Mgmt基因甲基化檢測(cè)引物探針體系及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基因突變的檢測(cè)產(chǎn)品以及該產(chǎn)品所用到的檢測(cè)引物和檢測(cè)體系， 屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 06-甲基鳥(niǎo)噪呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（06-methylguanine-DNA methyhransferase， MGMT)是一種DNA修復(fù)酶，是人類細(xì)胞中唯一的能去除DNA上鳥(niǎo)嘌呤06位點(diǎn)上致細(xì)胞毒性和 突變的烷化劑加合物，使損傷的鳥(niǎo)嘌呤恢復(fù)，從而能夠保護(hù)細(xì)胞免受抗烷化基團(tuán)的損害。啟 動(dòng)子甲基化是MGMT基因最常見(jiàn)的異常，與MGMT蛋白的表達(dá)密切相關(guān)，導(dǎo)致該基因轉(zhuǎn)錄停止， 蛋白表達(dá)減少。
[0003] 有研究顯示在膠質(zhì)瘤中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率越高，MGMT含量越低，腫瘤 惡性程度就越高。MGMT基因啟動(dòng)子甲基化還可用于臨床上評(píng)估不同膠質(zhì)瘤患者烷化劑化學(xué) 治療療效。在惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，MGMT啟動(dòng)子甲基化作為預(yù)測(cè)因子預(yù)測(cè)烷化劑如替莫唑 胺(TMZ)治療的獲益已得到驗(yàn)證，加拿大國(guó)家癌癥研究所(NCIC)和歐洲癌癥研究和治療組 織(EORTC)研究表明MGMT基因啟動(dòng)子甲基化的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者接受替莫唑胺治療后存活 時(shí)間顯著延長(zhǎng)。MGMT基因甲基化是膠質(zhì)瘤化療效果好的因素之一，檢測(cè)膠質(zhì)瘤病人血清中 MGMT基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可用來(lái)預(yù)測(cè)病人的預(yù)后及制定個(gè)體化的化療方案，這將在提高 化療療效，改善病人預(yù)后方面有著十分重要的意義。研究也顯示結(jié)直腸癌生成期間的MGMT 表觀遺傳沉默與CpG島在其啟動(dòng)子高甲基化有關(guān);此轉(zhuǎn)錄后基因沉默造成的結(jié)果是Ο6-烷基 鳥(niǎo)嘌呤加合物的DNA修復(fù)被削弱，并且對(duì)烷化劑尤其是達(dá)卡巴嗪和其口服前藥替莫唑胺的 化療敏感性增加。另外，骨肉瘤MGMT基因甲基化狀態(tài)與化療療效明顯負(fù)相關(guān)，MGMT基因啟動(dòng) 子甲基化狀態(tài)在判斷骨肉瘤患者化療療效中具有重要意義。
[0004] 目前，檢測(cè)甲基化的方法包括：1、甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶（Me thy 1 at ion-sensitive restriction Endonuclease ，MS_RE) 法。但識(shí)別的CG序列因酶的識(shí)別位點(diǎn)有限 故有局限性，且存在酶不完全消化引起的假陽(yáng)性問(wèn)題；2、甲基化特異性PCR法 (Methylation-specific PCR，MSP)，是目前較為常見(jiàn)的檢測(cè)基因甲基化的方法。MSP法的原 理是首先用亞硫酸鹽修飾處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶都被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶， 而甲基化的胞嘧啶則不變。設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后通 過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析，確定與引物互補(bǔ)的DNA序列的甲基化狀態(tài)。但是該方法對(duì)引物設(shè)計(jì) 要求非常高，一般會(huì)因?yàn)閬喠蛩猁}過(guò)度的處理，使得模板很難擴(kuò)增出來(lái)。MSP法目前多結(jié)合 巢式PCR法。巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對(duì)PCR引物擴(kuò)增。第一對(duì)PCR 引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似;第二對(duì)引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段 的內(nèi)部)結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的 好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò) 增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。MSP法結(jié)合巢式PCR擴(kuò)增的方法是設(shè)計(jì)針對(duì) 沒(méi)有變化的模板的一組引物;針對(duì)變化了的模板的一組引物;看哪組引物能擴(kuò)增出來(lái)從而 判斷模板有沒(méi)有變化，如果模板沒(méi)變化，就表示模板被甲基化了。MSP法結(jié)合巢式PCR擴(kuò)增的 方法能提高單一 MSP法的特異性，但操作時(shí)間長(zhǎng)，且相比MSP法同樣存在重亞硫酸鹽處理不 完全導(dǎo)致的假陽(yáng)性修飾過(guò)程中的pH值要絕對(duì)準(zhǔn)確、所有試劑要求新鮮配置，并且需要反復(fù) 摸索找出合適的反應(yīng)時(shí)間，造成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程繁瑣，且不能做到定量檢測(cè)，存在較高的假陽(yáng) 性率;也存在亞硫酸鹽處理過(guò)度，造成擴(kuò)增困難的情況；3、甲基化敏感性解鏈曲線分析法 (MS-High Resolution Melting Curve，MS_HRM)，操作繁瑣，假陽(yáng)性率高，且不適于大量樣 本的檢測(cè)；4、熒光法(Methylight)，由于探針的局限性，一般沒(méi)有合適的對(duì)照體系，假陽(yáng)性 率較高；5、亞硫酸氫鹽基因測(cè)序法(bisulfite sequencing PCR，BSP)，是PCR聯(lián)合Sanger測(cè) 序技術(shù)，結(jié)果準(zhǔn)確，但過(guò)程繁瑣，不適合大批量檢測(cè)，且價(jià)格昂貴不能廣泛使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種方案簡(jiǎn)潔，靈敏度高，準(zhǔn)確率高的MGMT基因 甲基化檢測(cè)試劑盒，以及其檢測(cè)引物探針和檢測(cè)體系。
[0006] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是:一種MGMT基因甲基化檢測(cè)引 物探針，包括用于判定基因組DNA質(zhì)量的引物探針組X、用于判定甲基化轉(zhuǎn)化率的引物探針 組Y和用于檢測(cè)MGMT基因啟動(dòng)子甲基化情況的引物探針組Z;
[0007 ] 所述引物探針組X包括正向引物a、反向引物a和探針a;
[0008] 所述引物探針組Y包括正向引物b、反向引物b和探針b;
[0009] 所述引物探針組Z包括正向引物b、反向引物b、探針c和探針d;
[0010]所述正向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示；
[0011]所述反向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0012]所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0013]所述正向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0014]所述反向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
[0015] 所述探針b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0016] 所述探針c的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
[0017] 所述探針d的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
[0018] 所述探針a、探針b和探針c的5'端設(shè)有報(bào)告熒光基團(tuán)，所述探針a、探針b、探針c和 探針d的3 '端設(shè)有淬滅熒光基團(tuán)。
[0019] 上述各引物應(yīng)用于PCR反應(yīng)中的終濃度為0.4μΜ;各探針應(yīng)用于PCR反應(yīng)中的終濃 度為0.2μΜ。
[0020] 上述探針a、探針b和探針c的5'端設(shè)有相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)。
[0021 ] 上述相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)有三種，第一種是FAM，第二種是HEX、VIC、TET或 Cy3，第三種是Cy5或R0X;所述淬滅熒光基團(tuán)是BHQ1。
[0022] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是：一種采用上述引物探針的 MGMT基因甲基化檢測(cè)試劑盒。
[0023] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是:一種MGMT基因甲基化檢測(cè)體 系，包括用于判定基因組DNA質(zhì)量的反應(yīng)體系X、用于判定甲基化轉(zhuǎn)化率的反應(yīng)體系Y和用于 檢測(cè)MGMT基因啟動(dòng)子甲基化情況的反應(yīng)體系Z;
[0024] 所述反應(yīng)體系X包括正向引物a、反向引物a、探針a、PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2和純 水；
[0025] 所述反應(yīng)體系Y包括正向引物b、反向引物b和探針b、PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2和純 水；
[0026] 所述反應(yīng)體系Z包括正向引物b、反向引物b、探針c、探針d、PCR緩沖液、dNTPs、 MgCh和純水；
[0027]所述正向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；
[0028] 所述反向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0029] 所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0030] 所述正向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[00311所述反向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
[0032] 所述探針b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0033] 所述探針c的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
[0034] 所述探針d的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
[0035] 所述探針a、探針b和探針c的5'端設(shè)有報(bào)告熒光基團(tuán)，所述探針a、探針b、探針c和 探針d的3 '端設(shè)有淬滅熒光基團(tuán)。
[0036]上述各反應(yīng)體系的組分中包括十倍濃度的PCR緩沖液1體積，2mM的dNTPs試劑1體 積，15mM的Mg