p70 和 TNF-alpha) 的劇烈產(chǎn)生。
[0131]如圖2所示，與由來自所有三種供體的單核細胞的混合物衍生的DC相比，由"單一" DC(來自被分析的三種不同外周血供體的DC)在使用刺激因子持續(xù)活化達18小時的過程中 產(chǎn)生的高平均水平的 MIP-lalpha(圖 2a)、MIP-lbeta(圖 2b)、RANTES(圖 2c)、MIG(圖 2d)是相 似的。特別地，在不同的單一供體DC之間，在活化誘導的趨化因子產(chǎn)量上有很大變化。如圖4 所示，與由來自所有三種供體的單核細胞混合物衍生的DC相比，通過活化"單一"DC而產(chǎn)生 的高平均水平的IL-12p70(圖3a)和TNF-alpha(圖3b)是相似的。特別地，在不同的單一供體 DC之間，在IL-12p70和TNF-alpha的產(chǎn)量上有很大變化。
[0132] 由ELISA分析獲得數(shù)據(jù)。所顯示的結果是從三個個體得到的平均值土SD以及從所 有三種供體的混合物得到的值。各Y軸顯示在18小時的持續(xù)刺激/活化過程中產(chǎn)生的各物質 的數(shù)量，單位為pg/ml/1 X 106個細胞。X軸顯示被測量的不同組合。
[0133] 已提出，前列腺素 E2(PGE2)在活化誘導的未成熟DC的耗竭中發(fā)揮核心作用 (Rieser C等，Differential Deactivation of Human Dendritic Cells by Endotoxin Desensitization:Role ofTumor Necrosis Factor-aand Prostaglandin E2(通過內毒素 脫敏而實現(xiàn)的人類樹突細胞的差異性去活化：腫瘤壞死因子和前列腺素 E2的作用）， Blood 91 (1998)3112-3117)。因此，我們研究，在異源單核細胞的共培養(yǎng)過程中加入Cox-2 抑制劑NS-398(旨在抑制PGE2的潛在產(chǎn)生)是否會在隨后的活化中增加促炎性趨化因子（由 MIG產(chǎn)量表示）或促炎性細胞因子（由IL-12p70產(chǎn)量表示）的產(chǎn)生。如圖4所示，Cox-2抑制劑 NS-398在單核細胞繁殖成DC的過程中的存在并未增加而是減少了 MIG和IL-12p70的活化誘 導產(chǎn)量。因此，沒有跡象顯示，PGE2介導的分化未成熟DC從混合異源單核細胞的培養(yǎng)物中耗 竭。
[0134] 通過ELISA分析獲得數(shù)據(jù)。所顯示的結果來自由所有三種供體的混合物構成的一 個實驗。各Y軸顯示在18小時的持續(xù)刺激/活化過程中產(chǎn)生的各物質的數(shù)量，單位為pg/ml/1 X 1〇6個細胞。X軸顯示被測量的不同組合。
[0135] 由混合的富含異源單核細胞的血塊黃層白細胞的共培養(yǎng)物衍生的未成熟DC在功 能上圭被耗竭。
[0136] 如圖5所示，與由來自所有三種供體的單核細胞的混合物衍生的DC相比，由"單一" DC(來自被分析的三種不同血塊黃層供體的DC)在使用刺激因子持續(xù)活化達18小時的過程 中所產(chǎn)生的高平均水平的活化誘導的促炎性趨化因子MIP-lalpha(圖5a)、MIP_lbeta(圖 5b)、RANTES(圖5c)、MIG(圖5d)是相似的。特別地，在不同的單一供體DC之間，在趨化因子產(chǎn) 量上有很大變化。
[0137] 如圖6所示，與由來自所有三種供體的富含單核細胞的白細胞混合物衍生的DC相 比，通過"單一" DC而產(chǎn)生的高活化誘導平均水平的IL-12p70(圖6a)和TNF-alpha(圖5b)是 相似的。特別地，在不同的單一供體DC之間，在IL-12p70和TNF-alpha的產(chǎn)量上有很大變化。
[0138] 通過ELISA分析獲得數(shù)據(jù)。所顯示的結果是從三個個體得到的平均值土SD以及從 所有三種供體的混合物得到的值。各Y軸顯示在18小時的持續(xù)刺激/活化過程中產(chǎn)生的各物 質的數(shù)量，單位為pg/ml/1 X 106個細胞。X軸顯示被測量的不同組合。
[0139] 由混合的異源外周血單核細胞的共培養(yǎng)物衍生的PI-DC呈現(xiàn)出促炎性趨化因子和 細胞因子的持續(xù)產(chǎn)生
[0140]為將活化的促炎性DC(PI-DC)注射到患者體內，通常必須在施用之前對其進行清 洗。如果不這樣做，有可能發(fā)生由同時施用刺激劑（旨在體外誘導PI-DC)而引發(fā)的不希望的 副作用。因此，在終止活化誘導因子之后，也必須將未成熟DC活化成能夠持續(xù)產(chǎn)生期望因子 的PI-DC。如圖7所示，與由來自所有三種外周血供體的單核細胞混合物衍生的PI-DC相比， 由"單一" PI-DC在撤回活化因子之后（由來自被分析的三種不同供體的外周血單核細胞得 到的 PI-DC)產(chǎn)生的平均水平的 MIP-lalpha(圖 7a)、MIP-lbeta(圖 7b)、RANTES(圖 7c)、MIG (圖7d)是相似的。特別地，在撤回活化因子之后，在不同單一供體的PI-DC之間，在趨化因子 產(chǎn)量上有很大變化。與由來自所有三種供體的單核細胞混合物衍生的清洗過的PI-DC相比， 由"單一" PI-DC在撤回活化因子之后產(chǎn)生的平均產(chǎn)量的IL-12p70(圖8a)和TNF-alpha(圖 8b)是相似的。特別地，在撤回活化因子之后，在不同單一供體的PI-DC之間，在細胞因子產(chǎn) 量上有很大變化。
[0141]通過ELISA分析獲得數(shù)據(jù)。所顯示的結果是從三個個體得到的平均值土SD以及從 所有三種供體的混合物得到的值。各Y軸顯示在撤回活化因子之后的24小時內所產(chǎn)生的各 物質的數(shù)量，單位為pg/ml/1 X 106個細胞。X軸顯示被測量的不同組合。
[0142]由混合的富含異源單核細胞的外周血塊黃層白細胞的共培養(yǎng)物衍生的PI-DC呈現(xiàn) 出促炎性趨化因子和細胞因子的持續(xù)強烈產(chǎn)生
[0143] 如圖9所示，與由來自所有三種血塊黃層供體的單核細胞混合物衍生的PI-DC相 比，由"單一"PI-DC在撤回活化因子之后（由來自被分析的三種不同供體的血塊黃層單核細 胞得到的 PI-DC)產(chǎn)生的平均水平的 MIP-lalpha(圖 9a)、MIP-lbeta(圖 9b)、RANTES(圖 9c)、 MIG(圖9d)是相似的。特別地，在不同的單一供體PI-DC之間，在趨化因子產(chǎn)量上有很大變 化。與由來自所有三種血塊黃層供體的單核細胞混合物衍生的清洗過的PI-DC相比，由"單 一" PI-DC在撤回活化因子之后產(chǎn)生的平均產(chǎn)量的IL-12p70(圖10a)和TNF-alpha(圖10b)是 相似的。特別地，在不同的單一供體PI-DC之間，在細胞因子產(chǎn)量上有很大變化。
[0144] 通過ELISA分析獲得數(shù)據(jù)。所顯示的結果是從三個個體得到的平均值土SD以及從 所有三種供體的混合物得到的數(shù)值。各Y軸顯示在撤回活化因子之后的24小時內所產(chǎn)生的 各物質的數(shù)量，單位為pg/ml/1 X 106個細胞。X軸顯示被測量的不同組合。
[0145] 由富含單核細胞的過濾器白細胞衍生的混合未成熟DC在活化后產(chǎn)生太量的促炎 性趨化因子和細胞因子
[0146] 如圖11所示，由富含單核細胞的過濾器白細胞(最初的白細胞群是從一 4-血塊黃 層去白細胞過濾器中清洗出來的)衍生的活化混合DC產(chǎn)生大量的MIP-lalpha(圖1 la)、MIP-lbeta(圖 llb)、RANTES(圖 11(：)、]\〇6(圖11(1)。如圖12所示，也產(chǎn)生大量的11^-12口70(圖123) 和 TNF-alpha(圖 12b)。
[0147] 通過ELISA分析獲得數(shù)據(jù)。所顯示的結果是從一實驗中得到的數(shù)值。各Y軸顯示在 18小時的持續(xù)刺激/活化過程中產(chǎn)生的各物質的數(shù)量，單位為pg/ml/1 X 106個細胞。
[0148] 由富含單核細胞的過濾器白細胞衍生的混合PI-DC在撤回活化因子后呈現(xiàn)出促炎 性趨化因子和細胞因子的大量產(chǎn)生
[0149] 如圖13所示，由過濾器白細胞(最初的白細胞群是從一4-血塊黃層去白細胞過濾 器中清洗出來的）衍生的活化混合DC在撤回活化因子后產(chǎn)生大量的MIP-lalpha(圖13a)、 MIP-lbeta(圖 13b)、RANTES(圖 13幻、]\〇6(圖13(1)。如圖14所示，也產(chǎn)生大量的11^-12口70(圖 14a)和TNF-alpha(圖14b)。通過ELISA分析獲得數(shù)據(jù)。所顯示的結果是從一實驗中得到的數(shù) 值。各Y軸顯示在撤回活化因子之后的24小時內所產(chǎn)生的各物質的數(shù)量，單位為pg/ml/1 X 1〇6個細胞。
【主權項】
1. 一種用于產(chǎn)生非耗竭未成熟樹突細胞(dendriticcell，DC)的方法，包括以下步驟： -提供異源白細胞混合物，所述異源白細胞已從至少兩種不同的異源供體中獲得； -將異源單核細胞從所述異源白細胞的混合物中分離出來，以提供富含單核細胞的異 源白細胞；以及 -從所述富含單核細胞的異源白細胞中產(chǎn)生非耗竭未成熟DC，其中通過在不含非人血 清的含水細胞培養(yǎng)基中共培養(yǎng)所述富含單核細胞的異源白細胞達2至7天，產(chǎn)生非耗竭未成 熟樹突細胞(DC)，且在所述培養(yǎng)基中添加有白介素-4(interleukin-4，IL-4)和粒細胞-巨 細胞菌落刺激因子（granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，GM_CSF)〇2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述細胞培養(yǎng)基至少包括人類多肽。3. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述人類多肽選自以下物質：轉鐵蛋白、白蛋白和 膜島素。4. 根據(jù)權利要求1至3之一所述的方法，其中所述富含單核細胞的異源白細胞包括異源 嗜中性粒細胞。5. 根據(jù)權利要求1至4之一所述的方法，其中所述異源白細胞混合物是通過匯集至少兩 種包含白細胞的血塊黃層提供的，所述待匯集的血塊黃層是從至少兩種不同的異源供體獲 得的。6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所述匯集的血塊黃層包含血小板或其血小板被耗 竭。7. 根據(jù)權利要求1至4之一所述的方法，其中所述異源白細胞混合物是通過下列方式獲 得的： -從至少兩個去白細胞過濾器中洗脫白細胞，所述過濾器先前已分別用于從全血中耗 竭白細胞，所述全血可從至少兩種不同的異源供體中獲得；以及 -匯集所獲得的白細胞，以獲得所述異源白細胞的混合物； 或通過以下方式獲得： -從去白細胞過濾器中洗脫白細胞，所述過濾器已用于從所匯集的血塊黃層中耗竭白 細胞，其中所匯集的血塊黃層源自至少兩種不同的異源供體。8. 根據(jù)前述權利要求中的任一所述的方法，其中所述異源單核細胞是通過淘析或抗 體/小珠分離而分離的。9. 根據(jù)前述權利要求中的任一所述的方法，其中所述共培養(yǎng)進行了約5天。10. 根據(jù)前述權利要求中的任一所述的方法，還包括將抗原負載到非耗竭未成熟DC上 的步驟。11. 一種源自至少兩種不同的異源供體的異源性非耗竭未成熟樹突細胞(DC)的混合 物，所述樹突細胞(DC)可通過權利要求1至10中任一所述的方法獲得。12. -種用于產(chǎn)生促炎性DC的方法，包括以下步驟： -根據(jù)權利要求1至11中的任一提供非耗竭未成熟DC;以及 -活化非耗竭未成熟DC，以獲得促炎性DC。13. 根據(jù)權利要求12所述的方法，其中所述活化是通過加入以下物質而被誘導的：Toll 樣受體3(TLR3)_配體聚-I:C;TLR7/8_配體，例如Resiquimod;以及干擾素gamma(IFN_γ)。14. 根據(jù)權利要求13所述的方法，其中所述活化誘導還包括加入至少一種選自以下物 質的物質來誘導激活:1'1^2-配體，1'1^4-配體，1'1^9-配體，干擾素&1口11&(1?1€〇，白介素比 (IL-Ιβ)，以及腫瘤壞死因子alpha(TNF-a)。15. 根據(jù)權利要求13至14中的任一所述的方法，其中所述活化不包括加入前列腺素E2 (PGE2)。16. 根據(jù)權利要求13至15中的任一所述的方法，其中未成熟DC暴露于活化因子中達8至 24小時，然后沖去基本上所有的活化因子。17. -種源自至少兩種不同的異源供體的異源性促炎性樹突細胞的混合物，所述樹突 細胞可通過權利要求12至16中任一所述的方法獲得。18. -種藥物組合物，包括根據(jù)權利要求16所述的異源促炎性樹突細胞的混合物、以及 至少一種藥學上可接受的載體。19. 根據(jù)權利要求17所述的異源促炎性樹突細胞的混合物，或根據(jù)權利要求18所述的 組合物，用于治療癌癥。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于產(chǎn)生源自兩種不同異源供體的非耗竭未成熟樹突細胞(DC)的方法。在該方法中，提供異源白細胞的混合物，其中所述異源白細胞已從至少兩種不同的異源供體中獲得。隨后，將異源單核細胞從異源白細胞的混合物中分離出來。最后，從所述分離的異源白細胞中生成非耗竭未成熟DC。
【IPC分類】C12N5/0786, C12N5/0784
【公開號】CN105452449
【申請?zhí)枴緾N201380066722
【發(fā)明人】亞歷克斯·卡森·帕拉, 本·安德森
【申請人】伊穆尼肯公司
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2013年12月18日
【公告號】CA2895280A1, EP2788474A1, EP2788474B1, EP2913394A1, EP2913394B1, US20150329823, WO2014096033A1