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      鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物的制作方法_3

      文檔序號(hào):9692669閱讀:來(lái)源:國(guó)知局
      tial For The Treatment Of Cancer and AIDS.Cancer J·8:185-189;Scanlon等,199501igonucleotides_mediated modulation of mammali an gene expression.FASEB J·9:1288;Gewirtz, 1993.Oligodeoxy nucleotide-based therapeutics for human leukemias?Stem Cells Dayt·11:96)〇
      [0171]反義寡核苷酸的序列靶片段選擇為使得該序列顯示出適合的對(duì)于與其互補(bǔ)模板 的寡核苷酸雙鏈體形成而言重要的能量相關(guān)特征,并顯示出就自二聚或自互補(bǔ)而言的低潛 力(Anazodo等,1996)。例如,計(jì)算機(jī)程序0LIG0(引物分析軟件,3.4版)可用來(lái)確定反義序列 解鏈溫度、自由能特性,并估計(jì)潛在自二聚體形成和自互補(bǔ)性質(zhì)。該程序允許這兩個(gè)參數(shù)的 定性估計(jì)的判定(潛在二聚體形成和自互補(bǔ)),并提供了"無(wú)潛力"或"一些潛力"或"基本上 完全潛力"的指示。使用這個(gè)程序,一般將靶片段選擇為具有這些參數(shù)沒(méi)有潛力的估計(jì)。然 而,其中一類具有"一些潛力"的片段可用。如在本領(lǐng)域中已知的,在選擇中利用參數(shù)的平 衡。此外,寡核苷酸同樣根據(jù)需要來(lái)選擇,使得類似物替代基本上不影響功能。
      [0172]硫代磷酸酯反義寡核苷酸在有效濃度時(shí)通常不顯示顯著的毒性,并且在動(dòng)物中表 現(xiàn)出充足的藥代動(dòng)力學(xué)半衰期(Agrawal,1996 .Antisense oligonucleotides : towards clinical trials,TIBTECH,14:376),并且是核酶抗性的。
      [0173] 單鏈寡核苷酸已示出在RNAi中工作,參見例如Lima等,(2012)Cell 150:883-894, 并由 Davidson 和 Monteys(2012)Cell 150:873-875綜述。
      [0174] RNAi寡核苷酸
      [0175] 細(xì)胞中長(zhǎng)dsRNA的存在激發(fā)被稱為"dicer"的核糖核酸酶III酶的活性(Bass, 2000, Cell,101,235; Zamore等,2000,Cel 1,101,25-33 ; Hammond 等,2000,Nature,404, 293)。0化61參與(181?財(cái)加工為稱為8丨麻或8丨1?財(cái)?shù)亩?181?財(cái)段化丨6〇6)(23111〇代等,2000, Cell,101,25-33;Bass,2000,Cell,101,235;Berstein等,2001,Nature,409,363)。來(lái)源于 dicer活性的短干擾RNA的長(zhǎng)度通常為約21至約23個(gè)核苷酸,并且包括約19個(gè)堿基對(duì)的雙鏈 體(Zamore等,2000,Cell,101,25-33;Elbashir等,2001,Genes Dev.,15,188) jicer還參 與從與翻譯控制有關(guān)的保守結(jié)構(gòu)的前體RNA切割21 -和2 2 -個(gè)核苷酸小臨時(shí)RNA (s t RNA) (Hutvagner等,2001,Science,293,834)。RNAi應(yīng)答的特征還在于核酸內(nèi)切酶化合物,通常 稱為RNA誘導(dǎo)的沉默化合物,其介導(dǎo)具有與siRNA雙鏈體之反義鏈互補(bǔ)的序列的單鏈RNA的 切害U。靶RNA的切割發(fā)生在與siRNA雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域中間(Elbashir等,2001, Genes Dev.,15,188)〇
      [0176] 已對(duì)多種系統(tǒng)中的RNAi進(jìn)行了研究。Fire等,1998,Nature,391,806,首先觀察了 秀剛隱桿線蟲(C. elegans)中的RNAi · Bahramian和Zarbl,1999,Molecular and Cellular Biology,19,274-283以及Wianny和Goetz,1999,Nature Cel 1 Biol ·,2,70描述了哺乳動(dòng)物 系統(tǒng)中的dsRNA介導(dǎo)的RNAi。Hammond等,2000,Nature,404,293描述了用dsRNA轉(zhuǎn)染的果繩 細(xì)胞中的1?財(cái)丨<^1匕3811化等,2001,似加代,411,494和1'118(^1等,國(guó)際?(:1'公開號(hào)¥0 01/ 75164描述了通過(guò)在包括人胚腎細(xì)胞和HeLa細(xì)胞在內(nèi)的培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引入合成 21-核苷酸RNA的雙鏈體誘導(dǎo)的RNAi。對(duì)果蠅胚胎裂解物的研究(Elbashir等,2001,EMB0 J.,20,6877和Tuschl等,國(guó)際PCT公開號(hào)W0 01/75164)披露了對(duì)介導(dǎo)高效RNAi活性所必需 的siRNA長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成和序列的某些要求。
      [0177] 核酸分子(例如,具有本文所公開的結(jié)構(gòu)特征)可通過(guò)以序列特異性方式介導(dǎo)RNA 干擾"RNAi"或基因沉默來(lái)抑制或下調(diào)基因表達(dá)或病毒復(fù)制;參見例如,Zamore等,2000, Cell,101,25-33;Bass,2001,Nature,411,428-429;Elbashir等,2001,Nature,411,494-498;和Kreutzer等,國(guó)際PCT公開號(hào)WO 00/44895;Zernicka-Goetz等,國(guó)際PCT公開號(hào)WO 01/36646;Fire,國(guó)際PCT公開號(hào)WO 99/32619;Mello和Fire,國(guó)際PCT公開號(hào)WO 01/29058; Li等,國(guó)際PCT公開號(hào)W0 00/44914; Hutvagner和Zamore,2002,Science,297,2056-60 ; McManus 等,2002,RNA,8,842-850。
      [0178] 對(duì)應(yīng)于已知基因的siRNA的選擇和合成已有廣泛報(bào)道;(參見例如Ui-Tei等,J Biomed Biotech·2006;2006:65052;Chalk等,BBRC·2004,319(1):264-74;Sioud&Leirdal, Met.Mol Biol.;2004,252:457-69;Levenkova等,Bioinform.2004,20(3):430-2;Ui-Tei 等,NAR.2004,32(3):936-48;De Paula等,RNA 2007,13:431-56)。
      [0179] 例如,經(jīng)修飾siRNA的用途和生成,參見例如,Braasch等,Biochem.2003,42(26): 7967-75;〇1辻等,尺祖,2003,9(9):1034-48;?(:1'公開恥 2004/015107(3加8611厶6)和恥02/ 44321(1\18(*1等)。美國(guó)專利號(hào)5,898,031和6,107,094描述了經(jīng)化學(xué)修飾的低聚物。美國(guó)專 利公開號(hào)2005/0080246和2005/0042647分別涉及具有交替基序的低聚化合物和具有經(jīng)化 學(xué)修飾核苷酸間鍵的核酸分子。
      [0180]其他修飾已被公開。5'-磷酸酯部分的并入示出增強(qiáng)果蠅胚胎中siRNA的活性 (Boutla等,Curr .Biol .2001,11:1776-1780),并且為人HeLa細(xì)胞中的siRNA功能所需 (Schwarz等,Mol .Cell,2002,10:537-48) jmarzguioui等(NAR,2003,31 (2) :589-95)示出 siRNA的活性依賴于2'-0_甲基修飾的定位。Holen等(NAR 2003,31 (9) :2401-07)報(bào)道了具 有小數(shù)量的2'-0_甲基修飾核苷的siRNA給出與野生型相比良好的活性,但該活性隨2'-0_ 甲基修飾核苷數(shù)目的增加而降低。Chiu和Rana(RNA. 2003,9:1034-48)描述了在有義或反義 鏈(完全修飾鏈)中經(jīng)2 ' -0-甲基修飾的核苷的并入相對(duì)于未經(jīng)修飾s iRNA而言顯著降低了 siRNA活性。據(jù)報(bào)道,在反義鏈5'端置入2'-0_甲基嚴(yán)重限制活性而置于反義的3'端和有義 的兩端被耐受(Czauderna等,NAR 2003,31 (11): 2705-16 ;W0 2004/015107)。本文所公開的 分子提供了這樣的優(yōu)點(diǎn),即它們穩(wěn)定且活躍,而且可用于制備用于治療各種疾病的藥物組 合物。
      [0181] 屬于本發(fā)明共同受讓人并通過(guò)引用整體并入本文的PCT專利公開號(hào)W02008/ 104978、W02009/044392、W0 2011/066475和W02011/084193公開了dsRNA結(jié)構(gòu)。
      [0182] 屬于本發(fā)明共同受讓人的PCT公開號(hào)W0 2008/050329和美國(guó)第11/978,089號(hào)涉及 促凋亡基因的抑制劑,并通過(guò)引用整體并入本文。
      [0183] PCT專利公開號(hào)W02004/111191和W0 2005/001043涉及用于增強(qiáng)RNAi的方法。
      [0184] 目前正在積極研究microRNA在癌癥中的作用,并且用于基因調(diào)節(jié)的新靶標(biāo)正在連 續(xù)鑒定出來(lái),參見例如1〇4〇和0〇〇6(2012沾]\?0 1〇1]\^(1 4:143-159和〇1611等,(2012) J·Biomed·Sci·19:90。
      [0185] 本文提供了將靶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)為與對(duì)照相比至少20%、30 %、40 %或50%的方 法,其包括使靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物與本文所公開的一種或更多種鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸 化合物相接觸。
      [0186] 還提供了本文所公開的一種或更多種鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物,其用于將 靶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)為與對(duì)照相比至少20%、30%、40%或50%。
      [0187] 還提供了本文所公開的一種或更多種鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物用于制備用 于將靶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)為與對(duì)照相比至少20%、30%、40%或50%的藥物的用途。
      [0188] 本文還提供了一種在哺乳動(dòng)物中將靶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)為與對(duì)照相比至少20%、 30%、40%或50%的方法,其包括將本文所公開的一種或更多種鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸分 子施用于所述哺乳動(dòng)物。
      [0189] 本文還提供了本文所公開的一種或更多種鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸分子用于將哺 乳動(dòng)物中靶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)為與對(duì)照相比至少20%、30%、40%或50%。
      [0190] 本文還提供了本文所公開的一種或更多種鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸分子在制備用 于將將哺乳動(dòng)物中靶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)為與對(duì)照相比至少20%、30%、40%或50%的藥物中 的用途。
      [0191] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中,所述哺乳動(dòng)物是人。
      [0192] 調(diào)芐基因表達(dá)是下調(diào)基因表達(dá)或上調(diào)基因表達(dá)。在一些實(shí)施方案中,調(diào)芐基因表 達(dá)是上調(diào)基因表達(dá)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中,調(diào)芐基因表達(dá)是下調(diào)基因表達(dá)。在一些實(shí)施 方案中,下調(diào)基因表達(dá)通過(guò)RNAi的方式發(fā)生。
      [0193] 在多種實(shí)施方案中,靶基因表達(dá)的下調(diào)選自由以下組成的組:下調(diào)基因功能(其例 如通過(guò)用天然基因/多肽等的已知相互作用因子進(jìn)行酶測(cè)定或結(jié)合測(cè)定來(lái)研究)、下調(diào)基因 的多肽產(chǎn)物(其例如通過(guò)Western印跡、ELISA或免疫沉淀等來(lái)研究)和下調(diào)基因的mRNA表達(dá) (其例如通過(guò)Northern印跡、定量RT-PCR、原位雜交或微陣列雜交等來(lái)研究)。
      [0194] 在其他實(shí)施方案中,調(diào)節(jié)是上調(diào),并且靶基因表達(dá)的上調(diào)選自由以下組成的組:上 調(diào)基因功能(其例如通過(guò)用天然基因/多肽等的已知相互作用因子進(jìn)行酶測(cè)定或結(jié)合測(cè)定 來(lái)研究)、上調(diào)基因的多肽產(chǎn)物(其例如通過(guò)Western印跡、ELISA或免疫沉淀等來(lái)研究)和上 調(diào)基因的mRNA表達(dá)(其例如通過(guò)Northern印跡、定量RT-PCR、原位雜交或微陣列雜交等來(lái)研 究)。
      [0195] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中,可用于與鞘脂-聚烷基胺綴合的寡核苷酸是RNA干擾 (RNAi)寡核苷酸。RNAi寡核苷酸是基于核酸的分子,其能夠以哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNA干擾途徑 機(jī)制通過(guò)相互作用誘導(dǎo)RNA干擾,從而以序列特異性方式降解或抑制轉(zhuǎn)基因的信使RNA (mRNA)轉(zhuǎn)錄物的翻譯。兩種主要的RNA i寡核苷酸是小(或短)干擾RNA (s i RNA)和微小RNA (miRNA或miRhRNAi寡核苷酸可以例如反義1?嫩、8丨8祖、8丨嫩、111丨8祖、雙鏈1?嫩((181?嫩)、短發(fā) 夾RNAbhRNAhRNAi寡核苷酸可以采用標(biāo)準(zhǔn)的合成劑化學(xué)合成或采用編碼能夠誘導(dǎo)RNAi之 RNA能的表達(dá)盒重組合成。在一些實(shí)施方案中,寡核苷酸是單鏈寡核苷酸或雙鏈寡核苷酸。 單鏈寡核苷酸包括反義分子(DNA、RNA或DNA/RNA嵌合體)和miRNA模擬物。雙鏈寡核苷酸包 括s iRNA、s iNA、shRNA和miRNA 〇
      [0196] RNAi寡核苷酸可以采用標(biāo)準(zhǔn)的合成劑化學(xué)合成或采用編碼能夠誘導(dǎo)RNAi之RNA的 表達(dá)盒重組合成。RNAi多核苷酸表達(dá)盒可以在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生小發(fā)夾RNA,其可作為siRNA, 獨(dú)立的有義和反義鏈線性siRNA或miRNA起作用。RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄的DNA包含選自如下列 表中的啟動(dòng)子:U6啟動(dòng)、H1啟動(dòng)子和tRNA啟動(dòng)子。RNA聚合酶II啟動(dòng)子包括U1、U2、U4和U5啟 動(dòng)子、snRNA啟動(dòng)子、微小RNA啟動(dòng)子和mRNA啟動(dòng)子。
      [0197] siRNA包含雙鏈結(jié)構(gòu),該雙鏈結(jié)構(gòu)一般含有15至49個(gè)堿基對(duì),優(yōu)選18至25個(gè)堿基 對(duì),并與在細(xì)胞中表達(dá)的靶基因或RNA中的編碼序列具有相同(完美互補(bǔ))或幾乎相同(部分 互補(bǔ))的核苷酸序列。siRNA可具有雙核苷酸3'突出。siRNA可以由兩個(gè)退火的多核苷酸或形 成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單個(gè)多核苷酸構(gòu)成。本發(fā)明的siRNA分子包含有義區(qū)和反義區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方 案中,綴合物的siRNA由兩個(gè)寡核苷酸片段裝配而成,其中一個(gè)片段包含所述siRNA分子的 反義鏈的核苷酸序列,第二片段包含所述siRNA分子的有義區(qū)的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施 方案中,有義鏈通過(guò)接頭分子與反義鏈相連,所述接頭分子例如多核苷酸接頭或非核苷酸 接頭。微小RNA(miRNA)是小的非編碼RNA基因產(chǎn)物,其長(zhǎng)度為約22個(gè)核苷酸并且指導(dǎo)其靶 mRNA的破壞或翻譯抑制。如果miRNA與革EmRNA之間的互補(bǔ)性是局部的,則革EmRNA的翻譯被抑 制。如果互補(bǔ)是廣泛的,則革EmRNA被切割。對(duì)于miRNA,所述化合物與通常位于mRNA的3 'UTR 的革EU立點(diǎn)相結(jié)合,該革E1位點(diǎn)通常與所述miRNA具有僅部分同源性。"種子區(qū)(seed region)"-miRNA的5'端上與其靶標(biāo)形成完美堿基配對(duì)的約七(7)個(gè)連續(xù)核苷酸延伸-對(duì)miRNA特異性 起著關(guān)鍵作用。RISC/miRNA化合物與mRNA的結(jié)合可導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯的抑制或mRNA的切割和 降解。最近的數(shù)據(jù)表明,如果沿所述miRNA的整個(gè)長(zhǎng)度具有完美同源性并且代之以其靶標(biāo)僅 在種子區(qū)示出完美堿基配對(duì),則mRNA切割優(yōu)先發(fā)生(Pillai等,2007)。 _8] 示例性鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸
      [0199] 下文提供的實(shí)例具有19個(gè)核苷酸的雙鏈體區(qū);然而,本文中公開的核酸分子可以 具有15至49個(gè)核苷酸或18至40個(gè)核苷酸的任意位置雙鏈體區(qū),并且其中每條鏈的長(zhǎng)度獨(dú)立 地為18至40個(gè)核苷酸。在每個(gè)雙鏈體中,反義鏈(N)x示出在上面。"SL"是指鞘脂-聚烷基胺 綴合物。鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸(雙鏈核酸分子)的非限制性實(shí)例具有以下結(jié)構(gòu):鞘脂-聚 烷基胺-dsRNA分子的非限制性實(shí)例具有如下結(jié)構(gòu)(在上的鏈5 ' >3 '代表反義鏈,在下的鏈3 ' >5"代表正義鏈):
      [0200] 5' (N)i9
      [0201] 3' SL-(N')i9
      [0202] 5' (N)i9
      [0203] 3' (N')i9-SL
      [0204] 5, (N)ig-SL
      [0205] 3' (N')19
      [0206] 5' (N)i9-C3Pi-C3Pi
      [0207] 3' (N')i9_SL
      [0208] 5, (N)i9-C3Pi_C3Pi
      [0209] 3, PiC3-(N,)i9_SL
      [0210] 5' (N)i9-dTdT
      [0211] 3' PiC3-(N')i9_SL
      [0212] 5' (N)i9-dTdT
      [0213] 3' dTdT-(N')i9_SL
      [0214] 5' (N)i9-C3Pi-C3Pi
      [0215] 3' dTdT-(N')i9_SL
      [0216] 5' (N)i9-dTdT-SL
      [0217] 3' PiC3-(N')i9_SL
      [0218] 5' (N)ig-C3Pi-C3Pi
      [0219] 3' SL-(N')i9-z"
      [0220] 5' (N)i9-C3Pi_C3Pi
      [0221] 3' H0C3-(N,)i9_SL
      [0222] 其中N和Ν'各自獨(dú)立地為未經(jīng)修飾的核糖核苷酸、經(jīng)修飾的核糖核苷酸或非常規(guī) 部分;
      [0223] 其中每個(gè)Ν通過(guò)共價(jià)鍵與相鄰的Ν相連;
      [0224] 其中每個(gè)Ν'通過(guò)共價(jià)鍵與相鄰的Ν'相連;
      [0225] 其中SL是與反義鏈或有義鏈的5'端或3'端共價(jià)連接的鞘脂-聚烷基胺綴合物;
      [0226] 其中C30H、C3Pi等是指共價(jià)連接在鏈的3'端的C3非核苷酸部分;
      [0227]其中dTdT是指胸苷二核苷酸;
      [0228] 其中z"是共價(jià)連接在有義鏈的5 '端的封端部分。
      [0229] 對(duì)于所有上述結(jié)構(gòu),在一些實(shí)施方案中,(N)x的寡核苷酸序列與(Ν')y的寡核苷酸 序列完全互補(bǔ)。在其他實(shí)施方案中,反義鏈和有義鏈基本互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中,(N)x與 哺乳動(dòng)物mRNA完全互補(bǔ)。在其他實(shí)施方案中,(N)x與哺乳動(dòng)物的mRNA基本互補(bǔ)。
      [0230] 還提供了一種藥物組合物,其包含有效抑制哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物基因表達(dá)的量 的本文所公開鞘脂-聚烷基胺化合物和藥學(xué)上可接受的載體,及其用于治療本文所公開的 任一疾病和病癥的用途。在一些實(shí)施方案中,哺乳動(dòng)物基因是人基因。在一些實(shí)施方案中, 所述非哺乳動(dòng)物基因與哺乳動(dòng)物疾病優(yōu)選人疾病有關(guān)。
      [0231] 還提供了用于在有此需要的受試者中治療或預(yù)防本文所公開癌癥的發(fā)病率或嚴(yán) 重性或用于降低本文所公開癌癥的風(fēng)險(xiǎn)或嚴(yán)重性的方法,其中所述癌癥和/或癥狀或相關(guān) 風(fēng)險(xiǎn)與哺乳動(dòng)物基因或非哺乳動(dòng)物基因的表達(dá)相關(guān),所述方法包括向有此需要的受試者施 用治療有效量的本文所公開的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所 述受試者為人受試者。本文提供了用于治療的雙鏈核酸分子。
      [0232] 還提供了用于治療或預(yù)防癌癥的發(fā)病率或嚴(yán)重性或用于降低癌癥的風(fēng)險(xiǎn)或嚴(yán)重 性的本文所公開的鞘脂-聚烷基胺化合物,其中所述癌癥和/或癥狀或相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)與哺乳動(dòng)物 基因或非哺乳動(dòng)物基因的表達(dá)相關(guān)。
      [0233] 還提供了本文公開的鞘脂-聚烷基胺化合物用于制備用于治療或預(yù)防癌癥的發(fā)病 率或嚴(yán)重性或用于降低癌癥的風(fēng)險(xiǎn)或嚴(yán)重性的藥物的用途,其中所述癌癥和/或癥狀或相 關(guān)風(fēng)險(xiǎn)與哺乳動(dòng)物基因或非哺乳動(dòng)物基因的表達(dá)相關(guān)。
      [0234] siRNA 合成
      [0235] 使用公共和專有算法生成潛在雙鏈RNA分子的有義和反義序列。
      [0236] 根據(jù)上述規(guī)格的寡核苷酸基本如本文所述制備。通過(guò)任何本領(lǐng)域中所熟知用于合 成核糖核酸(或脫氧核糖核酸)寡核苷酸的方法合成經(jīng)修飾核酸分子。合成通常在市售合成 儀(可得自Applied Biosystems等)中進(jìn)行。寡核苷酸合成在例如Beaucage和Iyer, Tetrahedron 1992;48:2223-2311;Beaucage和Iyer,Tetrahedron 1993;49:6123-6194以 及Carut hers等,Met hods Enzymol. 1987 ; 154:287-313中有述;硫代酯的合成描述于 Eckste in,Ann. Re v.Biochem. 1985; 54:367-402等中;RNA 分子的合成描述于Sproat,Humana Press 2005,Herdewijn Ρ·編著;Kap.2:17_31 中;并且各下游工藝描述于 Pingoud 等,IRL Press,1989,01iver R.W.A. ;Kap.7:183-208等中。
      [0237] 其他合成方法在本領(lǐng)域中是已知的,例如,Usman等,1987,J. Am. Chem. Soc.,109, 7845;Scaringe等,1990,NAR.,18,5433;Wincott等,1995,NAR.23,2677-2684;和Wincott 等,1997,Methods Mol.Bio.,74,59中所述的方法可利用常用核酸保護(hù)和偶聯(lián)組,例如5 '端 的二甲氧三苯甲基和3'端的亞磷酰胺。根據(jù)需要加入經(jīng)修飾(例如,2'-0_甲基化)核苷酸和 未經(jīng)修飾核苷酸。
      [0238]在一些實(shí)施方案中,本文所公開的寡核苷酸分開合成并在合成后例如通過(guò)連接反 應(yīng)連在一起(Moore等,1992,Science 256,9923;Draper等,國(guó)際專利公開號(hào)W0 93/23569; Shabarova等,1991,NAR 19,4247 ; Bel Ion等,1997,Nucleosides&Nucleotides,16,951; Bellon等,1997, Biocon jugate Chem. 8,204),或者通過(guò)在合成和/或解保護(hù)之后雜交。 [0239] 化學(xué)合成片段的重疊對(duì)(Overlapping pair)可采用本領(lǐng)域中公開的方法連接(例 如,參見美國(guó)專利號(hào)6,121,426)。所述鏈分開合成并在管中彼此退火。通過(guò)HPLC將雙鏈 siRNA與未退火(例如,因?yàn)槠渲幸环N過(guò)量)的單鏈寡核苷酸分離。至于本文所公開的鞘脂-聚烷基胺化合物,可以合成兩種或更多種這樣的序列并連在一起備用。
      [0240] 在一個(gè)實(shí)施方案中,提供了雙鏈核酸(例如,(1通嫩、5^1?^、以嫩),其下調(diào)哺乳動(dòng)物 或非哺乳動(dòng)物靶基因的表達(dá)。雙鏈分子在有義鏈和/或反義鏈上包含例如至少一個(gè)吡唑并 三嗪核苷酸類似物。在一些實(shí)施方案中,有義鏈包含源自靶RNA序列的核苷酸序列,反義鏈 與有義鏈互補(bǔ)。在一般情況下,與祀mRNA序列的一些偏差可以容忍而不會(huì)有損于siRNA活性 (參見例如Czauderna等,2003,嫩1?31(11),2705-2716)。本發(fā)明的(181?祖在轉(zhuǎn)錄后水平抑制 基因表達(dá)而不破壞mRNA。不受理論約束,dsRNA可以靶向用于特異性切割和降解的mRNA和/ 或可以抑制由靶信息翻譯。
      [0241 ] -方面,提供了核酸分子(例如,siNA分子),其中a)該核酸分子包括有義鏈和反義 鏈;b)該分子的每條鏈的長(zhǎng)度獨(dú)立地為15至49個(gè)核苷酸;(c)該反義鏈的15至49個(gè)核苷酸的 序列與靶RNA的序列互補(bǔ);d)至少一個(gè)鞘脂-聚烷基胺綴合物共價(jià)連接在有義鏈的3'端、反 義鏈的3'端或有義鏈的5'端;和e)有義鏈的15至49個(gè)核苷酸的序列與反義鏈的序列互補(bǔ), 并且包括靶RNA的15至49個(gè)核苷酸序列。
      [0242]在一些實(shí)施方案中,反義鏈與反義鏈的長(zhǎng)度相同。在一些實(shí)施方案中,反義鏈和有 義鏈的長(zhǎng)度是18至25或18至23或18至21或19至21或19個(gè)核苷酸。
      [0243]鞘脂-聚烷基胺綴合物與核苷酸或寡核苷酸的偶聯(lián)
      [0244] 可以在合成儀中將鞘脂-聚烷基胺亞磷酰胺綴合物與核苷酸的5'端相偶聯(lián),例如, 在合成的最后步驟?;蛘撸梢詫⑶手?聚烷基胺化合物與固體支持物相偶聯(lián),然后加入核 苷酸,以形成具有2 '或3 '鍵(鞘脂-聚烷基胺共價(jià)連接到寡核苷酸的末端核苷酸之糖的2 '或 3'位)的綴合物。另一種可能性是制備寡核苷酸,然后,在后合成步驟,除去所選核苷酸上合 適的保護(hù)基團(tuán)后
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