活力的影響
[0067]化合物（I)藥物在一定的濃度范圍才能發(fā)揮其藥理作用，而且不同的細胞體系對 藥物的敏感性也會有所不同。為此，首先用MTT法確定實驗用的藥物濃度范圍。結(jié)果如表1 (VS對照組#P〈0.01)顯示，不同濃度的化合物（I)對內(nèi)皮細胞的作用效應不同，低劑量的藥 物濃度(5~20yg/mL)細胞活性與對照組比較，沒有統(tǒng)計學差異。40yg/mL作用48小時后細胞 活力下降了約50%，80yg/mL作用48小時后細胞活力下降了70%，與對照組比較有統(tǒng)計學差 異(P〈0.01)，產(chǎn)生了一定的毒副作用。因此本實驗所用的化合物（I)濃度為5、10、20yg/mL， 以排除藥物自身對細胞的毒性作用。
[0068] 2、不同濃度ox-LDL對臍靜脈內(nèi)皮細胞活力的影響
[0069] 由于氧化低密度脂蛋白氧化程度的差異，氧化低密度脂蛋白的細胞毒性范圍會有 所不同。因此我們先采用MTT確定ox-LDL細胞毒的范圍。結(jié)果如表2(VS對照組乍〈0.05#P〈 0.01)所示，不同濃度ox-LDL對HUVEC細胞活性影響不同。與對照組相比，10yg/mL組有促進 HUVEC細胞活性增加的趨勢，但與對照組比較沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05); 20~100yg/mL各組 內(nèi)皮細胞活性隨濃度增加而減少，與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P〈〇. 05或P〈0.01)。
[0070] 3、化合物(I)對ox-LDL誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的干預作用
[0071 ]結(jié)果如表3(VS.ox-LDLgroup#P〈0·01)所示，ox_LDL(50yg/mL)組的細胞活性下 降，與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P〈〇.〇l)，說明ox-LDL組細胞活性顯著降低，〇x-LDL(50yg/ mL)對正常HUVEC具有損傷作用?；衔铫挪煌瑒┝拷M的細胞活性均高于ox-LDL組，與ox-LDL組比較差異有統(tǒng)計學意義(P〈0.01)，說明此三個劑量組的細胞活性顯著高于ox-LDL組， 提示化合物（I)可抑制ox-LDL誘導的HUVEC損傷。化合物（I) 10yg/mL和化合物（I) 20yg/mL組 的細胞活性高于化合物（I)5yg/mL組，與化合物（I)5yg/mL比較有統(tǒng)計學差異(P= 0.01或卩〈 〇. 01)。化合物（I) 20μ8/ιΛ細胞活性較化合物（I) 10yg/mL組有升高趨勢，但沒有統(tǒng)計學差異 (P= 0.185)。提示化合物(I)的內(nèi)皮保護作用在一定范圍內(nèi)具有量效關系。
[0072] 4、化合物(I)對ox-LDL誘導損傷的臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的影響
[0073] 各組流式細胞結(jié)果顯示：各組細胞的凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(P〈0.01 )，ox-LDL組的增殖指數(shù)明顯升高，與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P〈〇.〇l)說明〇X-LDL(50yg/mL)對正 常HUVEC具有損傷作用?；衔铮↖)不同劑量組的凋亡率均低于ox-LDL組，與ox-LDL組比較 差異有統(tǒng)計學意義(P〈〇.01)，說明此三個劑量組的凋亡率顯著低于ox-LDL組，提示化合物 (I)可抑制ox-LDL誘導的HUVEC凋亡?；衔铮↖)不同劑量組的凋亡率隨著劑量升高逐漸降 低，各組之間差異有統(tǒng)計學意義(P〈〇.01)。結(jié)果見表4(VSox-LDLgroup#P〈0.01)。提示化 合物(I)的內(nèi)皮保護效應在一定范圍內(nèi)具有量效關系。
[0074]結(jié)論，本研究采用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)化合物（I)能明顯提高ox-LDL損傷的人臍靜脈內(nèi) 皮細胞的細胞活力，說明其具有抑制ΟX-LDL誘導的ΗUVEC損傷的作用。進一步采用 AnnexinV-FITC、PI雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)各濃度組化合物（I)均能顯 著減少ox-LDL誘導的HUVEC凋亡，并且效果呈劑量依賴性。提示化合物（I)能通過抑制ox-LDL誘導的HUVEC凋亡來實現(xiàn)內(nèi)皮保護作用。
[0075] 表1不同濃度化合物⑴對HUVEC細胞活力的影響（i±s，:n= 6)

[0077] 表2 OX-LDL對HUVEC細胞活力的影響G±s，n=6)
[0079] 表3不同劑化合物（I)對ox-LDL誘導HUVEC損傷的干預作用（x±s:，.n= 6)
[0081]表4不同劑量化合物⑴對OX-LDL誘導HUVEC凋亡的作用G±s，n= 3)
[0083] 實施例3
[0084]片劑的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:7的 比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0085] 實施例4
[0086] 口服液的制備:按實施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口 服液。
[0087] 實施例5
[0088] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒 石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0089] 實施例6
[0090] 注射液的制備:按實施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾， 灌封滅菌制成注射液。
[0091] 實施例7
[0092] 無菌粉針的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水 中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封 得粉針劑。
[0093] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術方案的實質(zhì)和保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物α):2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含以下操作步驟：（a)將香鱗 毛蕨的干燥葉粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、 乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取 物；（b)步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體積，再用70%乙醇 洗脫8個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1、60:1、35:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇 梯度洗脫得到5個組分;（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、 15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分;（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵 合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中，用75%乙醇熱 回流提取，合并提取液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物（I) 和藥學上可接受的載體。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備內(nèi)皮細胞保護的藥物中的應用。7. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備內(nèi)皮細胞保護的藥物中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的倍半萜類化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途，屬于藥物技術領域。該化合物為首次報道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的倍半萜類化合物，可以從香鱗毛蕨的干燥葉中提取、分離純化得到。體外試驗證明該化合物能顯著減少ox-LDL誘導的HUVEC凋亡，并且效果呈劑量依賴性，可以用來開發(fā)成內(nèi)皮細胞保護的藥物。
【IPC分類】A61K31/11, C07C47/36, A61P43/00, C07C45/78, A61P9/00
【公開號】CN105461531
【申請?zhí)枴緾N201610019439
【發(fā)明人】鄭平珍
【申請人】鄭平珍
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2016年1月12日