毒性實(shí)驗(yàn)
[0132] 轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl質(zhì)粒復(fù)合物的制備
[0133] 室溫下，在PE管里分別加入7a_7f制備的轉(zhuǎn)基因載體，其中轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl 的N/P比為2，4，8，16，pEGFP-Nl質(zhì)粒質(zhì)量為1.875yg，加入相應(yīng)體積的DMEM，使反應(yīng)液的最終 體積保持在300μL。放入37°C恒溫水浴中，保溫1個(gè)小時(shí)。
[0134] 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
[0135] 用胰酶消化收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和HepG2細(xì)胞將大約每孔7000個(gè)細(xì)胞種入96孔 板中，于37°C含5%⑶2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)，使細(xì)胞的生長(zhǎng)至70%-80%的融合。棄去孔 內(nèi)原有培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗1-2次，在每孔中分別加入上述配好的不同濃度的轉(zhuǎn)基因載 體與pEGFP-Nl質(zhì)粒復(fù)合物lOOyL，每個(gè)濃度設(shè)置三個(gè)平行孔;采用不含轉(zhuǎn)基因載體的DMEM培 養(yǎng)基作為空白對(duì)照，采用商業(yè)化Lipofectamine2000作為陽(yáng)性對(duì)照，不含細(xì)胞只有DMEM作 為空白對(duì)照。4小時(shí)后將所有培養(yǎng)基吸出，向其中每孔加入200yL含10%FBS的DMEM，于培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，向每孔加入1OyLMTT溶液，4小時(shí)后吸出所有加入液，生成的紫藍(lán)色結(jié) 晶用150yLDMS0溶解，于搖床上震蕩10分鐘后用酶標(biāo)儀測(cè)定每一孔在490nm處的吸光度值。 按如下公式計(jì)算細(xì)胞存活率（％ ) = [A490test-空白]/[A490control-空白]X100。
[0136] 如圖2所示，經(jīng)過在HepG2和A549細(xì)胞中測(cè)定上述六種轉(zhuǎn)基因載體的細(xì)胞毒性，發(fā) 現(xiàn)這六種細(xì)胞毒性都比較低。在A549細(xì)胞中，N/P比為2和4的時(shí)候，細(xì)胞的成活率都在80% 左右?？傮w呈現(xiàn)的規(guī)律是：隨著氮磷比的增加，細(xì)胞調(diào)亡數(shù)目增加，這是由于轉(zhuǎn)基因載體氮 原子可以增加細(xì)胞毒性;DNA量一定，隨著氮磷比的增加，轉(zhuǎn)基因載體濃度增加，毒性增大。 因此為了達(dá)到細(xì)胞毒性小并且轉(zhuǎn)染率高的目的，選擇比較合適的氮磷比相當(dāng)重要。
[0137] (3)轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl質(zhì)粒復(fù)合物的粒徑實(shí)驗(yàn)
[0138]轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl質(zhì)粒復(fù)合物的制備
[0139]室溫下，在PE管里分別加入轉(zhuǎn)基因載體，其中轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl的N/P比為4， pEGFP-Nl質(zhì)粒質(zhì)量為0.25yg，加入相應(yīng)體積的超純水，使反應(yīng)液的最終體積保持在500yL， 離心混合均勻。放入37°C恒溫水浴中，保溫1個(gè)小時(shí)。（掃描電鏡實(shí)驗(yàn)中，不需要稀釋，直接把 轉(zhuǎn)基因載體與DNA的復(fù)合物滴加到硅片上，室溫自然晾干）。
[0140]粒徑以及形貌測(cè)試
[0141]用反應(yīng)液反復(fù)潤(rùn)洗比色皿，最后將500yL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至比色皿中進(jìn)行測(cè)定。設(shè)定測(cè) 試溫度為25.00°C，每次測(cè)定收集10組平行數(shù)據(jù)取平均值。
[0142]如圖3所示，利用動(dòng)態(tài)激光光散射技術(shù)，我們研究了轉(zhuǎn)基因載體與DNA凝聚后的粒 徑。形成的凝聚試劑均可與DNA形成130-220nm大小的顆粒，這為成功穿入細(xì)胞膜實(shí)現(xiàn)基因 轉(zhuǎn)染具有重要的意義。
[0143] (4)轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl的復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
[0144]轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl復(fù)合物的制備
[0145]室溫下，在PE管里分別加入轉(zhuǎn)基因載體，其中轉(zhuǎn)基因載體與pEGFP-Nl的N/P比為4， pEGFP-Nl質(zhì)粒質(zhì)量為1.25yg，加入相應(yīng)體積的DMEM，使反應(yīng)液的最終體積保持在200yL，輕 輕吹打混勻，放入37°C恒溫水浴中，保溫半個(gè)小時(shí)；并通過此方法制備轉(zhuǎn)基因載體 Lipofectamine2000與pEGFP-Nl質(zhì)粒的復(fù)合物作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
[0146]體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
[0147]用胰酶消化收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞將大約每孔7.0X104-9.0X104個(gè)細(xì)胞種 入共聚焦培養(yǎng)皿中，于37°C含5%C02的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)，使細(xì)胞的生長(zhǎng)至70%-80%的 融合。棄去孔內(nèi)原有培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗1-2次，在每孔中分別加入上述配好的轉(zhuǎn)基因載 體與pEGFP-Nl質(zhì)粒復(fù)合物200yL。4小時(shí)后將所有培養(yǎng)基吸出，向其中每孔加入500yL含10 % FBS的DMEM，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，取出共聚焦培養(yǎng)皿在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP蛋 白表達(dá)情況。
[0148] 按照上述的方法制備轉(zhuǎn)基因載體Lipofectamine2000與pEGFP-Nl的復(fù)合物，按照 上述的方法將轉(zhuǎn)基因載體Lipofectamine2000與pEGFP-Nl復(fù)合物加入到A549細(xì)胞中進(jìn)行體 外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
[0149]如圖4所示，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)可以得出：由7a_7f制備的轉(zhuǎn)基因載體都可以攜帶 熒光質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，而化合物7c，7f表現(xiàn)出最好的轉(zhuǎn)染效果，其轉(zhuǎn)染效果已經(jīng)超 過商品化的轉(zhuǎn)染效率比較好的lipofectamine2000,通過實(shí)驗(yàn)得出，在形成轉(zhuǎn)基因載體過 程中DOPE的加入可以使得化合物將DNA凝聚成合適大小的顆粒，同時(shí)可以提高一定的轉(zhuǎn)染 效率。通過一系列實(shí)驗(yàn)得出：實(shí)驗(yàn)合成的陽(yáng)離子轉(zhuǎn)基因載體具有細(xì)胞相容性，具有作為基因 治療中非病毒載體的潛力。
[0150]綜上所述，本發(fā)明中的脂肪鏈的引入可以有效降低DNA的凝聚濃度，并利用其疏水 性功能與DNA形成納米顆粒通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞中。設(shè)計(jì)合成的7a-7f六個(gè)化合物可以高 效地凝聚DNA，形成的轉(zhuǎn)基因載體對(duì)HepG2與A549的MTT實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞毒性很低，合成的轉(zhuǎn)基 因載體與DOPE形成的化合物對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出很好的轉(zhuǎn)染效果，有些 甚至超過商品化的Lipofectamine2000,這為含[12]aneN3單元化合物作為基因載體的進(jìn) 一步研究做了很好的鋪墊，其制備方法簡(jiǎn)單、成熟、易于掌控。
[0151]盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列 運(yùn)用。它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域。對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地 實(shí)現(xiàn)另外的修改。因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限 于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種含大環(huán)多胺[12]aneN3的陽(yáng)離子脂質(zhì)，所述陽(yáng)離子脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)式(I)如下：式(I)中，R為長(zhǎng)鏈脂肪酸。2. 如權(quán)利要求1所述的含大環(huán)多胺[12]aneN3的陽(yáng)離子脂質(zhì)，其中，R為3. -種制備權(quán)利要求1所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)的方法，其合成路線如下：其中，R如權(quán)利要求1所定義，所述方法具體步驟包括： 步驟一、向溶解有式1化合物的乙腈溶液中加入1，3_二溴丙烷，攪拌回流反應(yīng)8~10小 時(shí)，減壓濃縮除去溶劑得到黃色固液混合物，向其中加入乙醇和氫溴酸，攪拌回流反應(yīng)7~8 小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，靜置，用水萃取有機(jī)層，合并水層，減壓濃縮得到淺黃色或者白色固體， 將固體真空干燥得到式2化合物，將式2化合物溶解于四氫呋喃中，于冰水浴中加入三乙胺 和叔丁氧羰基酸，室溫反應(yīng)8~10小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)柱層析分離得到式3化合物； 步驟二、所述步驟一得到的式3化合物與疊氮化鈉于N，N-二甲基甲酰胺中加熱反應(yīng)8~ 10小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，向體系內(nèi)加入飽和食鹽水，然后用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，用飽和 食鹽水洗滌有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥有機(jī)相后濃縮溶劑得到式4化合物； 步驟三、將所述步驟二得到的式4化合物溶于無(wú)水的四氫呋喃與甲醇混合液，其中，無(wú) 水的四氫呋喃與甲醇的體積比為1:1，攪拌下向體系中加入催化劑，在氫氣氛圍下反應(yīng)8~ 10小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，減壓抽濾，濾液減壓濃縮得到式5化合物； 步驟四、將所述步驟三得到的式5化合物與長(zhǎng)鏈脂肪酸攪拌反應(yīng)得到式6化合物； 步驟五、將所述步驟四得到的式6與三氟乙酸攪拌反應(yīng)得到式7化合物陽(yáng)離子脂質(zhì)。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，在所述步驟四中，具體步驟包括:將長(zhǎng)鏈脂肪酸溶解 于三氯甲烷中，加入二環(huán)己基碳二亞胺，于冰水浴下攪拌，待產(chǎn)生白色沉淀時(shí)，加入式5化合 物與4-二甲氨基吡啶，將混合物在冰浴下攪拌24小時(shí)后，減壓抽濾，得到濾液減壓旋干后加 入乙酸乙酯，在冰浴下再次攪拌0.5小時(shí)后，再次減壓抽濾，得到濾液旋干后進(jìn)行柱層析，所 述柱層析采用的洗脫劑為乙酸乙酯與甲醇，其中，乙酸乙酯與甲醇的體積比為30:1。5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，在所述步驟五中，具體步驟包括:將步驟四得到的式 6化合物溶于無(wú)水二氯甲烷中，于冰浴下，向其中滴加入溶有三氟乙酸的二氯甲烷溶液，室 溫下攪拌6小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑與過量的三氟乙酸減壓旋干，用二氯甲烷-正己烷重結(jié) 晶得到式7化合物陽(yáng)離子脂質(zhì)。6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，在所述步驟二中，式3化合物與疊氮化鈉的摩爾比為 1:1.5，加熱反應(yīng)的溫度為68°C。7. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，在所述步驟三中，所述催化劑為鈀碳催化劑，其中， 式4化合物與鈀碳催化劑的質(zhì)量比為10:1。8. -種轉(zhuǎn)基因載體，由權(quán)利要求1所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)、二油酰磷脂酰乙醇胺和高純滅菌 緩沖液組成，其中，所述陽(yáng)離子脂質(zhì)的摩爾濃度為2.OmM，所述陽(yáng)離子脂質(zhì)與所述二油酰磷 脂酰乙醇胺的摩爾比為1:2。9. 一種制備權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因載體的方法，所述方法具體包括步驟:將所述陽(yáng)離 子脂質(zhì)、二油酰磷脂酰乙醇胺與無(wú)水氯仿加入到高溫滅菌的燒瓶中，溶解后減壓濃縮得到 轉(zhuǎn)基因載體膜，將所述轉(zhuǎn)基因載體膜真空干燥去除殘留氯仿，干燥后的轉(zhuǎn)基因載體膜與預(yù) 先預(yù)熱到70°C的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液混合配成所需濃度的溶液，超聲得到所述 轉(zhuǎn)基因載體，其中，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的摩爾濃度為1 OmM，pH為7.4。10. 權(quán)利要求1所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)在制備轉(zhuǎn)基因載體中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種含大環(huán)多胺[12]aneN3的陽(yáng)離子脂質(zhì)以及含有該陽(yáng)離子脂質(zhì)的轉(zhuǎn)基因載體。本發(fā)明還公開了所述陽(yáng)離子脂質(zhì)和轉(zhuǎn)基因載體的制備方法。本發(fā)明提供的陽(yáng)離子脂質(zhì)含有脂肪酸鏈，可以有效降低DNA的凝聚濃度，并利用其疏水性功能與DNA形成納米顆粒通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞中，利于跨膜，采用陽(yáng)離子脂質(zhì)形成的轉(zhuǎn)基因載體具有低的細(xì)胞毒性，具有較高的轉(zhuǎn)染效率；陽(yáng)離子脂質(zhì)和轉(zhuǎn)基因載體的制備方法簡(jiǎn)單、成熟、易于掌控。
【IPC分類】C07D255/02, C12N15/87, C07C51/41, C07C53/18, A61K48/00
【公開號(hào)】CN105461646
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610021249
【發(fā)明人】盧忠林, 盧富華, 高永光, 張影
【申請(qǐng)人】北京師范大學(xué)
【公開日】2016年4月6日
【申請(qǐng)日】2016年1月13日