[0140] 以上實(shí)施例制備的本發(fā)明的化合物，每個(gè)化合物用DMS0稀釋至10mM后，依次稀釋 至 1ιιΜ、100ηΜ、10ηΜ、1ηΜ、0· 1ηΜ、0·OlnM。
[0141] 1.2 試劑
[0142]BTK(Bruton，styrosinekinase,Bruton釀氨酸蛋白激酶），購(gòu)自于日本Carna Biosciences公司；
[0143]二甲基亞諷（Dimethylsulfoxide,DMS0)，購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司；
[0144]EDTA，購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司；
[0145] 96 孔板（96wellplate)，購(gòu)自于美國(guó)Corning公司；
[0146] 384孔板（384wellplate)，購(gòu)自于美國(guó)Corning公司。
[0147]1X激酶緩沖液（50mMHEPES,ρΗ7· 5, 0· 0015%Brij-35, 10mMMgCl2, 2mMDTT)，臨 用前配制；
[0148]終止液（lOOmMHEPES,ρΗ7· 5, 0· 015%Brij-35, 0· 2%CoatingReagent#3,50mM H)TA)，臨用前配制。
[0149] 1.3 儀器
[0150] LabChipEZReader，購(gòu)自于美國(guó)Caliper公司。
[0151] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0152] 1)取每個(gè)濃度的化合物溶液10μ1至96孔板中，加入90μ11X激酶緩沖液；同 時(shí)設(shè)立DMS0對(duì)照組和無(wú)酶活對(duì)照組，均僅含10μ1DMS0和90μ11X激酶緩沖液。各組在 室溫下混勻l〇min，然后分別轉(zhuǎn)移5μ1至384孔板中；
[0153] 2)將激酶ΒΤΚ溶于1X激酶緩沖液，配制成2. 5X激酶溶液，然后轉(zhuǎn)移10μ12. 5X 激酶溶液至上述含各濃度化合物的384孔板中；DMS0對(duì)照組加入10μ12. 5X激酶溶液；無(wú) 酶活對(duì)照組加入10μ1不含激酶的IX激酶緩沖液。室溫下孵育l〇min;
[0154] 3)將FAM標(biāo)記的多肽和ATP溶于1X激酶緩沖液，配制成2. 5X底物溶液，然后轉(zhuǎn) 移10μ12. 5X底物溶液至上述384孔板中，28°C孵育lhr;
[0155] 4)各孔中加入25μ1終止液終止反應(yīng)；
[0156] 5)置于LabChipEZReader上讀取轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)，并計(jì)算抑制率I%，計(jì)算公式為 I% = (Max-Conversion) / (Max-Min)X100,其中Max為DMS0 對(duì)照組的轉(zhuǎn)化率，Min為無(wú)酶 活對(duì)照組的轉(zhuǎn)化率，Conversion為化合物處理組的轉(zhuǎn)化率。數(shù)據(jù)經(jīng)XLfit處理，擬合得IC5Q。 IC5。值表示與未加化合物處理組相比，化合物抑制50 %酶活力時(shí)對(duì)應(yīng)的化合物濃度。IC5。結(jié) 果見(jiàn)表1。
[0157]表1
[0158]
[0159] 本發(fā)明的化合物抑制BTK激酶的IC5。范圍在nM級(jí)別，體現(xiàn)了良好的BTK激酶抑制 活性。
[0160] 實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明的化合物體外細(xì)胞活性評(píng)價(jià)
[0161] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0162] 1.1化合物
[0163] 以上實(shí)施例制備的本發(fā)明的化合物，每個(gè)化合物用DMS0稀釋至10mM，依次稀釋為 20uM、10uM、luM、ΙΟΟηΜ、10ηΜ、1ηΜ、0· 1ηΜ〇
[0164] 1.2試劑
[0165] RPMI-1640,購(gòu)自于美國(guó)Invitrogen公司；
[0166] FBS，購(gòu)自于美國(guó)Invitrogen公司；
[0167] 培養(yǎng)基：RPMI 1640和FBS按體積比4:1配制。
[0168] EDTA，購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司；
[0169]96孔板（96well plate)，購(gòu)自于美國(guó)Corning公司；
[0170] C'clITiter-Gloii.Luminescent Cell Viability Assay Kit，購(gòu)自于美國(guó)Progema公 司；
[0171] Backseal膜，購(gòu)自于美國(guó)Perkin Elmer公司。
[0172] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0173] 1) Mino (ATCC: CRL3000)細(xì)胞培養(yǎng)：
[0174] 細(xì)胞復(fù)蘇：將Mino細(xì)胞置于37度水浴中溶解，然后轉(zhuǎn)移到15ml已預(yù)熱的培養(yǎng)基 中，lOOOrpm離心5分鐘，棄去培養(yǎng)基，用15ml新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至T75培養(yǎng)瓶中， 置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基。
[0175] 細(xì)胞傳代：將上述復(fù)蘇的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50ml無(wú)菌離心管中，lOOOrpm離心5分鐘，棄 去培養(yǎng)基，取分散均勻的細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整合適的細(xì)胞濃度到15ml新鮮培養(yǎng)基，加入到T75培 養(yǎng)瓶中，置于37度，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0176] 2)實(shí)驗(yàn)步驟：
[0177] T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長(zhǎng)至lX105-lX106Cells/ml后，使用新鮮培養(yǎng)基 (RPMI1640+20%FBS)重懸，并計(jì)數(shù)。將重懸的細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至10,000cells/ml， 20, 000cells/ml,30, 000cells/ml,50, 000cells/ml,80,OOOcells/ml,100,OOOcells/ml, 150,OOOcells/mland200, 000cells/ml8個(gè)濃度梯度。將細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 中，每孔加入 100P1 (1，〇〇〇cells/well，2,OOOcells/well，3,OOOcells/well，5,OOOcells/ well,8,OOOcells/well，10,OOOcells/well，15,OOOcells/welland20,OOOcells/well)〇 每種濃度兩復(fù)孔，鋪三塊板。7211后向待測(cè)孔加入10(^1(^丨丨丁丨1〇1*-0丨〇:§.1^1111；[116806111:0611 ViabilityAssaybuffer。輕輕搖勻。10分鐘后，在Assay板底部貼上Backseal膜，置 于Envison上讀取突光讀數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞存活率（cellsurvive(%))，計(jì)算公式為cell survive(% )=(藥物孔讀數(shù)-MinV(Max-Min)，其中Max為溶媒對(duì)照組的讀數(shù)，Min為無(wú) 細(xì)胞對(duì)照組的讀數(shù)，藥物組為化合物處理組的讀數(shù)，數(shù)據(jù)經(jīng)XLfit處理，擬合得IC5。，實(shí)驗(yàn)結(jié) 果見(jiàn)表2。
[0178] 表 2
[0179]

[0180] 本發(fā)明的化合物體外Mino細(xì)胞也表現(xiàn)出了良好的抑制活性。
[0181] 實(shí)驗(yàn)例3本發(fā)明的化合物的BTK占有率評(píng)價(jià)
[0182] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0183] 1.1化合物
[0184] 以上實(shí)施例制備的本發(fā)明的化合物，每個(gè)化合物用CMC-Na溶解至6mg/ml，給藥劑 量為 30mg/kg。
[0185] 1.2 試劑
[0186] RBC溶液緩沖液，購(gòu)自于美國(guó)波斯頓生物制品公司；
[0187] 培養(yǎng)基：RPMI完全培養(yǎng)基；
[0188] 小鼠抗BTK抗體，購(gòu)自于貝克頓迪克遜BectonDickinson公司；
[0189] 二次山羊抗小鼠HRP抗體，購(gòu)自澤姆德Zymed公司；
[0190] 涂有抗生蛋白鏈菌素的ELISA板，購(gòu)自于美國(guó)皮爾斯公司；
[0191] 拜耳瑞德溶解緩沖液，購(gòu)自美國(guó)Biorad公司；
[0192] 重組BTK，購(gòu)自美國(guó)英杰公司；
[0193] B220+抗體-磁珠粒結(jié)合物。購(gòu)自德國(guó)美天旎公司；
[0194] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0195] 經(jīng)口給予大鼠30mg/kg化合物，并在化合物處理后2小時(shí)或24小時(shí)后收集脾臟。 在覆有毛玻璃的2個(gè)顯微鏡之間破壞大鼠的脾臟，以回收單細(xì)胞懸浮液。通過(guò)在室溫下與 RBC溶解緩沖液一起培育2分鐘來(lái)溶解紅細(xì)胞，隨后將這些細(xì)胞再懸浮于RMPI完全培養(yǎng)基 中，并借助離心使其聚結(jié)成團(tuán)。通過(guò)用B220+抗體-磁珠粒結(jié)合物進(jìn)行陽(yáng)性選擇來(lái)分離大 鼠B細(xì)胞，借助MACS柱進(jìn)行純化，并以106個(gè)細(xì)胞/100ul的濃度溶于拜耳瑞德溶解緩沖液 中進(jìn)行溶解，加入探針化合物使其達(dá)到終濃度luM，在室溫下，于混合板中振蕩培育1小時(shí)， 以使探針結(jié)合于游離的BTK。一起培育后，將樣品添加到經(jīng)過(guò)洗滌的涂有抗生蛋白鏈霉素的 ELISA板上，并在室溫下振蕩培育1小時(shí)。隨后使用自動(dòng)洗板機(jī)，用含有0. 05%Tween-20 的PBS洗滌板。在含0. 5%BSA的PBS(含0. 05%Tween-20)中以1:1000的稀釋度制備抗 BTK抗體，并添加到ELISA板中。在室溫下，振蕩培育1小時(shí)。如上文所述，洗滌板，并在含 0. 5 %BSA的PBS(含0. 05%Tween-20)中以1:5000的稀釋度制備抗二次HRP抗體。培育 板，如上文所述進(jìn)行洗滌。將TMB添加到板中，并監(jiān)測(cè)0D65。，直達(dá)到1個(gè)0D單位。隨后通過(guò) 添加H2S04使反應(yīng)終止。使用Gen5軟件對(duì)板進(jìn)行分析，并使用4參數(shù)邏輯斯蒂（4Parameter Logisticcurve)曲線定量樣品。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用重組BTK。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。
[0196]表 3
[0197]

[0198] 上述結(jié)果表明本發(fā)明的化合物維持藥效的時(shí)間較長(zhǎng)，經(jīng)歷24小時(shí)候依然保持較 高的BTK占有率。
[0199] 盡管以上已經(jīng)對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在不偏離本發(fā)