一種可在線檢測的全脫乙酰化殼寡糖不同聚合度單體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及殼寡糖制備領(lǐng)域。更具體地，涉及一種可在線檢測的全脫乙?；瘹す?糖不同聚合度單體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 殼聚糖由氨基葡糖或乙酰氨基葡萄糖殘基通過β-1，4糖苷鍵連接而成，是一種天 然存在的線性多糖，由于其安全性、生物相容性、可降解性等優(yōu)良性能，目前已被廣泛應(yīng)用 于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、廢水處理、生物材料等領(lǐng)域。殼寡糖是殼聚糖的降解產(chǎn)物，聚合度在2-20范圍內(nèi)，由于分子量低，水溶性大大增加，更易被生物體吸收，因而表現(xiàn)出比殼聚糖更優(yōu) 越的生理活性。2014年4月16日國家衛(wèi)生計生委將殼寡糖列為新的食品添加劑。近年來，殼 寡糖及其衍生物被報道具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、增強免疫、抗炎止血、增強骨骼等多種生 理作用，有很大的潛在藥物應(yīng)用價值。
[0003]迄今為止，報道的殼寡糖的生物活性實驗大部分都是采用殼寡糖混合物進行的， 很難明確具體是哪個或哪些殼寡糖分子在生物活性試驗中起作用。因此，為了進一步研究 殼寡糖的生物活性，從殼寡糖混合物中分離得到帶有單一聚合度和確定脫乙酰度的殼寡糖 是十分必要的。目前，有多種方法分離殼寡糖得到不同聚合度的殼寡糖單體，如凝膠色譜 [CN102174064Α]，離子交換色譜[CN102653569Α]，親和色譜等，然而無論哪種分離方 式，洗脫曲線的繪制均通過小體積收集組分，添加化學(xué)試劑顯色，測定吸光度來確定寡糖含 量或者通過TLC點板顯色，然后合并組分，進行后續(xù)處理。整個過程一需要接數(shù)百個組分，進 行數(shù)百個顯色反應(yīng)，過程繁瑣，方式僵硬，浪費時間，人力和物力；另一方面，在擴展到不同 的批次的分離生產(chǎn)時，則不能保證準(zhǔn)確度，不能實現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)，生產(chǎn)速率低，影響后續(xù)實驗 進程。故快速、簡便、易于擴大生產(chǎn)的殼寡糖的分離技術(shù)對于推動殼寡糖行業(yè)的基礎(chǔ)研究和 應(yīng)用研究有著重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個目的在于提供一種可在線檢測的全脫乙酰化殼寡糖不同聚合度單 體的制備方法。
[0005]本發(fā)明還提供了一種采用上述方法制備得到的全脫乙酰化殼寡糖不同聚合度單 體。采用本發(fā)明方法得到的殼寡糖利用HPLC檢測其純度，其中全脫乙?；瘹ざ侵翚ち?純度大于90 %。
[0006]為達到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0007] -種可在線檢測的全脫乙?；瘹す烟遣煌酆隙葐误w的制備方法，包括如下制備 步驟：
[0008] 1)選取分子量〈1000的全脫乙酰化殼寡糖進行醇沉、冷凍干燥、溶解過濾處理；
[0009] 2)將溶解過濾處理后的全脫乙酰化殼寡糖用離子交換色譜柱SPSepharoseHP以 0-3M濃度的NaCl溶液在2-8mL/min的流速下進行分離，進行紫外吸收在線檢測，按峰值小體 積收集組分，合并峰尖位置收集的組分并進行濃縮；
[0010] 3)將濃縮后的組分用凝膠柱SephadexG10以去離子水為緩沖液在4-12ml/min的 流速下進行脫鹽，通過紫外在線檢測糖含量，通過電導(dǎo)在線檢測脫鹽程度，收集脫鹽組分， 將組分冷凍干燥，即得到單一聚合度的全脫乙?；瘹す烟?。
[0011] 優(yōu)選地，步驟1)中，醇沉處理是指將全脫乙?；瘹す烟侨苡谌ルx子水，加入乙醇進 行沉淀，沉淀后過濾，去除聚合度>6的高聚合度殼寡糖(離子交換色譜柱對高聚合度殼寡糖 分離效果不好），提高分離效率。將濾液冷凍干燥待用。
[0012] 優(yōu)選地，步驟1)中，醇沉處理過程加入的乙醇體積為全脫乙酰化殼寡糖溶液的3-5 倍。
[0013] 優(yōu)選地，步驟1)中，溶解過濾處理是指將醇沉處理后的全脫乙?；瘹す烟窃谒嵝?緩沖液中溶解，而后用微孔濾膜過濾除菌后待用。
[0014] 優(yōu)選地，步驟1)中，所述緩沖溶液的pH為3-6的醋酸-醋酸鈉溶液。殼寡糖在酸性條 件下，氨基帶正電荷，使其能被陽離子交換柱吸附。
[0015] 優(yōu)選地，步驟1)中，所述微孔濾膜的孔徑為〇. 45μπι。
[0016] 優(yōu)選地，步驟2)及步驟3)中，所述紫外吸收在線檢測的檢測波長為190-220nm。選 擇此波長范圍，是因為殼寡糖在這個范圍內(nèi)存在較強的吸收峰。
[0017] 優(yōu)選地，步驟3)中，所述單一聚合度的全脫乙?；瘹す烟堑慕Y(jié)構(gòu)式如式（1)所示， 其中，η為2、3、4、5或6。
[0019]進一步地，本發(fā)明還公開了采用上述的制備方法制備得到的全脫乙?；瘹す烟遣?同聚合度單體，所述單體的純度大于90%。
[0020] 現(xiàn)有技術(shù)中，中國專利CN102653569Α公開的內(nèi)容與本申請最為接近。但是，與CN102653569A相比，本申請首次采用紫外檢測器對殼寡糖的分離過程進行在線監(jiān)測，儀器顯 示的紫外吸收曲線圖譜即為洗脫曲線，根據(jù)曲線收集組分，直觀精準(zhǔn)，方便靈活且節(jié)省時 間。無需像以往方法，對全部分離溶液進行小體積收集，然后每一小管取少量樣品添加顯色 試劑，在沸水浴中加熱顯色，測紫外吸收。用得到的數(shù)百個紫外吸收數(shù)值，繪制洗大致的脫 曲線，最后根據(jù)洗脫曲線，合并峰尖位置收集管內(nèi)組分。同理，使用凝膠脫鹽處理時，亦可簡 單直觀的知道糖組分出現(xiàn)的時間和脫鹽狀況。
[0021] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0022] 1、本發(fā)明采用離子交換色譜分離得到高純度的單一聚合度系列殼寡糖(二糖至六 糖），具有流速快、分辨率高、分離步驟少等特點。
[0023] 2、本發(fā)明首次采用紫外檢測器對殼寡糖的分離過程進行在線監(jiān)測，方便靈活，節(jié) 省時間，減少人力物力投入，有利于進一步放大生產(chǎn)。
[0024] 3、本發(fā)明使用凝膠柱對組分進行脫鹽處理，同時檢測寡糖與鹽含量，具有流速快、 步驟簡單、效率高等特點。
[0025] 4、本發(fā)明采用本發(fā)明方法得到的殼寡糖利用HPLC檢測其純度，其中全脫乙?；瘹?二糖至殼六糖純度均大于90%。
【附圖說明】
[0026]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0027]圖1示出本發(fā)明實施例1中陽離子交換色譜柱的洗脫曲線。
[0028]圖2示出五個分離組分與殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC對比圖。
[0029]圖3A-E示出本發(fā)明實施例方法制備得到的分離組分單一聚合度的全脫乙?；瘹?寡糖的HPLC譜圖，其中圖3A為組分1的譜圖，主要成分為殼二糖，圖3B為組分2的譜圖，主要 成分為殼三糖，圖3C為組分3的譜圖，主要成分為殼四糖，圖3D組分4的譜圖，主要成分為殼 五糖，圖3E組分4的譜圖，主要成分為殼六糖。
【具體實施方式】
[0030]為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說 明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體 描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護范圍。
[0031] 實施例1
[0032] 取10g全脫乙?；瘹す烟?分子量〈1000)溶于去離子水150ml，加入4倍體積的乙醇 進行沉淀，沉淀后過濾，濾液濃縮后進行冷凍干燥得到粉體。
[0033]將所得到的粉體用pH為4的醋酸緩沖液溶解后，經(jīng)孔徑為0.45μπι的微孔濾膜過濾 后，用陽離子交換色譜柱SPSepharoseHP在AKTAavant150蛋白分離系統(tǒng)上進行分離，以 1M濃度的NaCl溶液，在2mL/min的流速下進行洗脫，通過在線檢測190nm處的紫外吸收，按峰 收集組分:峰值>100mAU，每只收集管的收集體積為2ml。根據(jù)曲線圖合并在峰尖附近的組 分，具體洗脫位置分別為9 · 84cV、11 · 83cV、14 · 36cV、17 · 10cV和19 · 74cV。
[0034] 將所得組分依次濃縮后，用凝膠柱SephadexG10以去離子水為緩沖液在5ml/min 的流速下依次進行脫鹽，通過190nm紫外吸收在線檢測糖含量，通過電導(dǎo)率在線檢測脫鹽程 度，按峰收集:峰值> 150mAU，每只收集管的收集體積為lml。合并峰尖處的收集管組分，最后 將組分依次冷凍干燥，即得到單一聚合度全脫乙?；瘹す烟牵浣Y(jié)構(gòu)如下所示，η為2、3、4、5 或6。
[0036]實施例2
[0037] 取15g全脫乙?；瘹す烟?分子量〈1000)溶于去離子水150ml，加入5倍體積的乙醇 進行沉淀，沉淀后過濾，濾液濃縮后進行冷凍干燥得到粉體。
[0038] 將所得到的粉體用pH為5的醋酸緩沖液溶解后，經(jīng)孔徑為0.45μπι的微孔濾膜過濾 后，用陽離子交換色譜柱SPSepharoseHP在AKTAavant150蛋白分離系統(tǒng)上進行分離，以 2皿濃度的NaCl溶液，在5mL/min的流速下進行洗脫，通過在線檢測200nm處的紫外吸收，按峰 收集組分:峰值>120mAU，每只收集管的收集體積為1.5ml。根據(jù)曲線圖合并在峰尖附近的組 分，具體洗脫位置分別為10.12(^、12.77(^、15.41(^、18.36(^和21.55(^。如附圖1所示，為 該實施例陽離子交換色譜柱的洗脫曲線。
[0039] 將所得組分依次溶縮后，用凝膠柱SephadexG10以去離子水為緩沖液在9ml/min的流速下依次進行脫鹽，通過210nm紫外吸收在線檢測糖含量，通過電導(dǎo)率在線檢測脫鹽程 度，收集無鹽組分:峰值>150mAU，每只收集管的收集體積為lml。合并峰尖處的收集管組分， 最后將組分依次冷凍干燥，即得到單一聚合度全脫乙?；瘹す烟牵浣Y(jié)構(gòu)如下所示，η為2、 3、4、5或 6〇
[0041 ] 實施例3
[0042] 取20g全脫乙?；瘹す烟?分子量〈1000)溶于去離子水200ml，加入3倍體積的乙醇 進行沉淀，沉淀后過濾，濾液濃縮后進行冷凍干燥得到粉體。
[0043]將所得到的粉體用pH為6的醋酸緩沖液溶解后，經(jīng)孔徑為0.45μπι的微孔濾膜過濾 后，用陽離子交換色譜柱SP Sepharose HP在AKTA avant 150蛋白分離系統(tǒng)上進行分離，以 3皿濃度的NaCl溶液，在8mL/min的流速下