高親和力hiv t細胞受體的制作方法
【專利說明】高親和力HIVT細胞受體
[0001 ]本發(fā)明專利申請是第201210563915.4號中國發(fā)明專利申請的分案申請，該第 201210563915.4號申請是國際申請?zhí)枮椋?^/682006/001147、國際申請日為2006年3月29 日、進入中國國家階段的申請?zhí)枮?200680011470.Γ、發(fā)明名稱為"高親和力HIVΤ細胞受 體"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 本發(fā)明涉及對HIVGag多肽衍生的SLYNTVATL-HLA-A*0201具有結(jié)合特性的Τ細胞 受體(TCR)。該TCR包含至少一個TCRa鏈可變區(qū)和/或至少一個TCR0鏈可變區(qū)，其對于所述 SLYNTVATL-HLA-A*0201 復(fù)合物的KD 小于或等于ΙμΜ和 / 或?qū)LYNTVATL-HLA-A*0201 復(fù)合物 的解離速率(kQff)為1X1 (r3S<或更慢。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 人免疫缺陷病毒(HIV)是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的致病因子。該病毒是屬 于慢病毒群(grOup)中的一種被膜逆轉(zhuǎn)錄病毒。SLYNTVATL(SEQIDN0:16)肽衍生自Gag基 因的gl7基因產(chǎn)物，Gag基因是構(gòu)成人免疫缺陷病毒-l(HIV-l)的九個基因中的一個。該肽由 HLA-A*0201負載，并呈遞到HIV感染細胞的表面。因此，SLYNTVATL-HLA-A2*0201復(fù)合物提供 了一種TCR可靶向的HIV標記，例如為將細胞毒劑或免疫刺激劑遞送到感染細胞的目的。然 而，對于該目的，如果TCR對肽-HLA復(fù)合物具有高親和力和/或慢的解離速率將是有利的。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 本發(fā)明首次提供了對SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的親和力(KD)小于或等于ΙμΜ 和/或解離速率(Wf)為lxKTt1或更慢的TCR，前提是當所述TCR由細胞遞呈且包含SEQID NO: 1和2時，所述細胞不是天然T細胞。此類TCR不論單用或是與治療劑一起使用對于靶向遞 呈該復(fù)合物的HIV感染細胞都是很有利的。
[0007] 發(fā)明詳述
[0008] 本發(fā)明提供了一種T細胞受體(TCR)，其對SLYNTVATL-HLA-A*0201具有結(jié)合特性， 并包含至少一個TCRa鏈可變區(qū)和/或至少一個ΤΟ?β鏈可變區(qū)，它的特征在于所述TCR對于所 述SLYNTVATL-HLA-A*0201 復(fù)合物的KD 小于或等于ΙμΜ和 / 或?qū)τ赟LYNTVATL-HLA-A*0201 復(fù) 合物的解離速率(kQff)為1x10-3S-1或更慢，前提是當所述TCR由細胞遞呈且包含SEQIDN0: 1和2時，該細胞不是天然T細胞。
[0009] 可采用任何已知的方法測定KD和/或(koff)。一種優(yōu)選的方法是實施例4中的表面 等離子共振(SurfacePlasmonResonance，Biacore)方法。
[0010] 為了比較，通過實施例4的基于Biacore方法測定親本HIVgagTCR(TCRa鏈見SEQ IDNO:9，TCR0鏈見SEQID勵：10)的二硫鍵連接的可溶性變體與51^階￥411-!11^-4*0201復(fù) 合物相互作用的KD約為85nM，解離速率(koff)為2.21X1(T2S-1，半衰期為0.17分鐘。
[0011] SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的特異性親本HIVGagTCR具有以下的Va鏈和Ve鏈 基因用途：
[0012] α鏈-TRAV12.2
[0013] β鏈-TRBV5.6
[0014]可將親本HIVGagTCR用作模板來產(chǎn)生本發(fā)明的其它TCR，所述其它TCR對于所述 TCR與SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物之間的相互作用的高親和力高和/或解離速率慢。因 此，相對于親本HIVGagTCRa鏈可變區(qū)（參見圖la和SEQIDNo:l)和/或β鏈可變區(qū)（參見圖 lb和SEQIDNO:2)，本發(fā)明的TCR在其至少一個互補決定區(qū)（CDR)和/或可變區(qū)框架區(qū)發(fā)生 突變。本發(fā)明也考慮了本發(fā)明TCR可變區(qū)中的其它超變區(qū)（例如超變4(HV4)區(qū)）可在高親和 力突變TCR中發(fā)生突變。
[0015] 噬菌體展示為產(chǎn)生TCR變體文庫提供了一種手段。（Li等，（2005)NatureBiotech 23(3) :349-354)和WO2004/04404詳述了適于噬菌體展示和隨后的TCR變體文庫篩選的方 法，所述TCR變體各含有非天然鏈間二硫鍵。
[0016] 天然TCR以異二聚化的αβ或γδ形式存在。然而，現(xiàn)已顯示由單條TCRTCRa或ΤΟ?β 鏈組成的重組TCR可結(jié)合肽MHC分子。
[0017]在一個實施方式中，本發(fā)明的TCR包括a鏈可變區(qū)和TCRi3鏈的可變區(qū)。
[0018] TCRa鏈序列和/或TCRi3鏈序列中的突變可為一個或多個取代、缺失或插入，這對于 本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的?？捎萌魏魏线m的方法來實現(xiàn)這些突變，這些方法包括 但不限于:基于聚合鏈式反應(yīng)(PCR)方法、基于限制性內(nèi)切酶的克隆方法、或不依賴于連接 反應(yīng)的克隆(LIC)方法。這些方法在許多標準分子生物學(xué)教材中有所詳述。關(guān)于聚合酶鏈式 反應(yīng)（PCR)誘變法和基于限制性內(nèi)切酶的克隆法更為詳盡的描述可參見（Sambr〇〇k& Russell，（2001)MolecularCloning-ALaboratoryManual(3rdEd.)《分子克隆實驗室指 南》第三版，CSHLPress)。關(guān)于LIC法的進一步描述可見于(Rashtchian，（1995)CurrOpin Biotechnol6(1):30_6)。
[0019] 應(yīng)注意到包含相似Va和νβ基因應(yīng)用并由此氨基酸序列與HIVGag相似的任何αβ TCR可用來制作便利的模板TCR。然后可能將產(chǎn)生本發(fā)明突變的高親和力TCR所需的改變引 入編碼模板aCTCR的一個或兩個可變區(qū)的DNA中。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知道可通過許多方 法，例如定點誘變引入所需的突變。
[0020] 與圖la和SEQIDNo:l的親本HIVGagTCRa鏈可變區(qū)序列中這些位置的氨基酸相 比，本發(fā)明TCR包含那些在對應(yīng)于以下所列的一個或多個TCRa鏈可變區(qū)的氨基酸發(fā)生突變 的TCR〇
[0021] 除非另有相反陳述，本文的TCR氨基酸序列一般含有N-末端甲硫氨酸(Met或Μ)殘 基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知該殘基在重組蛋白產(chǎn)生過程中可以除去。本領(lǐng)域技術(shù)人員也顯然 知道，可將其C-末端和/或Ν-末端的序列截短1、2、3、4、5個或更多個殘基，而基本不影響該 TCR的pMHC結(jié)合性能，本發(fā)明包括所有這些不重要的變體。
[0022]本文所用的術(shù)語"可變區(qū)"應(yīng)理解為包括給定TCR的不包含在由TCRa鏈的TRAC基因 或TCRi3鏈的TRBC1或TRBC2基因所編碼的恒定區(qū)內(nèi)的所有氨基酸(序列）。（《T細胞受體手冊》 (TcellreceptorFactsbook)，（2001)，LeFranc和LeFranc，科學(xué)出版社，ISBN0-12-441352-8)〇
[0023] 本文所用的術(shù)語"可變域"應(yīng)理解為包括給定TCR的由TCRa鏈的TRAC基因或TCRf3鏈 的TRBV基因所編碼的所有氨基酸（序列^(《T細胞受體手冊》（Tcellreceptor Factsbook)，（ 2001)，LeFranc和LeFranc，科學(xué)出版社，ISBN0-12-441352-8) 〇
[0024]本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，在本文定義的可變區(qū)和恒定區(qū)之間交界處由密碼子所編 碼的氨基酸中發(fā)生變異可導(dǎo)致TCR庫（repertoire)的部分多樣性。例如，存在于親本HIV GagTCR序列中該交界處的密碼子(突變)導(dǎo)致本文可變區(qū)序列的C-末端存在組氨酸(Η)殘 基。該組氨酸取代了圖8a所示，TRAC基因編碼的Ν-末端天冬酰胺(Ν)殘基。
[0025] 本發(fā)明的實施方式中包括含有對應(yīng)于以下一個或多個α鏈可變區(qū)氨基酸發(fā)生突變 的突變性TCR:95Τ、96Ν、97S、98G和100Α，例如以下氨基酸：
[0026] 95S或G
[0027] 96Α
[0028] 97Η
[0029] 98D
[0030] 100S
[0031 ] 以上的編號與圖la和SEQIDNo: 1中所示的編號一致。
[0032] 本發(fā)明的實施方案也包括對應(yīng)于以下所列的一個或多個TCRi3鏈可變區(qū)氨基酸相 對于圖lb和SEQIDNo: 2的天然HIVGagTCRf3鏈可變區(qū)中這些位置的氨基酸發(fā)生突變的 TCR。所指示的可能發(fā)生突變的氨基酸是:51Y、52E、53E和54E，例如：
[0033] 51V或A
[0034] 52R或L
[0035] 53G
[0036] 54V
[0037] 以上的編號與圖lb和SEQIDNo:2中所示的編號一致。
[0038] 本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方式是含有圖6所示突變的α鏈可變區(qū)氨基酸序列之一的 TCRJSEQIDN〇:ll到13)。這種TCR的表型沉默變體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
[0039] 本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方式是含有圖7所示突變的β鏈可變區(qū)氨基酸序列之一的 TCRJSEQID如：^和^穴這種^^的表型沉默變體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
[0040] 天然TCR存在異源二聚體αβ或γδ形式。然而，目前已顯示由αα或邱同源二聚體構(gòu) 成的重組TCR能與肽MHC分子結(jié)合。因此，本發(fā)明的一個實施方式是TCRaa或TCR邱同源二聚 體。
[0041] 本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方式是含有下列α鏈可變區(qū)氨基酸序列和β鏈可變區(qū)氨基 酸序列組合的本發(fā)明的TCR，這類TCR的表型沉默變體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分：
[0043]在另一優(yōu)選實施方案中，含有以上詳述的可變區(qū)組合的本發(fā)明TCR還含有圖8a所 示α鏈恒定區(qū)氨基酸序列（SEQIDN0:19)以及圖8b和8c所示β鏈氨基酸恒定區(qū)序列之一 (SEQIDΝ0:20和21)或其表型沉默變體。
[0044] 本文所用的術(shù)語"表型沉默變體"應(yīng)理解為指對所述SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合 物的KD小于或等于ΙμΜ和/或具有1X1(T3S4或更慢的解離速率(koff)的那些TCR。例如，本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知可能產(chǎn)生與以上詳述的那些TCR相比，在其恒定和/或可變區(qū)中摻入了較小 變化但不改變與SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物相互作用的親和力和/或解離速率的TCR。本 發(fā)明范圍包括這類不重要的變體。其中含有一個或多個保守取代的那些TCR也構(gòu)成本發(fā)明 的一部分。
[0045] 就廣義而言，本發(fā)明TCR可以如W0 04/033685和W0 03/020763所述為單鏈TCR (scTCR)或二聚體TCR(dTCR)形式。
[0046]合適的scTCR形式包括：由對應(yīng)于TCRa鏈可變區(qū)的氨基酸序列構(gòu)成的第一區(qū)段，由 對應(yīng)于TCRi3鏈可變區(qū)序列并與對應(yīng)于TCRi3鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合 的氨基酸序列構(gòu)成的第二區(qū)段，和連接該第一區(qū)段C末端與該第二區(qū)段N末端的接頭序列。
[0047]或者，所述第一區(qū)段可由對應(yīng)于TCRi3鏈可變區(qū)氨基酸序列構(gòu)成，所述第二區(qū)段可 由對應(yīng)于TCRa鏈可變區(qū)序列并與對應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融 合的氨基酸序列構(gòu)成。
[0048]以上scTCR在第一和第二鏈之間還含有二硫鍵，所述二硫鍵在天然αβΤ細胞受體中 沒有等價物，其中該接頭序列的長度和該二硫鍵的位置應(yīng)使第一和第二區(qū)段的可變區(qū)序列 的相互取向基本上如天然αβΤ細胞受體中的那樣。
[0049] 更具體地說，所述第一區(qū)段可由對應(yīng)于TCRa鏈可變區(qū)序列并與對應(yīng)于TCRa鏈恒定 區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構(gòu)成，第二區(qū)段可由對應(yīng)于TCRi3鏈 可變區(qū)序列并與對應(yīng)于TCRi3鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列 構(gòu)成，和在第一和第二鏈之間可以存在天然αβΤ細胞受體中沒有等價物的二硫鍵。
[0050] 在以上scTCR形式中，接頭序列可連接第一區(qū)段C末端和第二區(qū)段Ν末端，其可如 式_PGGG_(SGGGG)n-P-所不，其中η是5或6，P是腫氨酸，G是甘氨酸，S是絲氨酸。
[0051] -PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQIDNO：17)
[0052] -PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQIDNO：18)
[0053] 本發(fā)明TCR的合適dTCR形式包括:第一多肽，其中對應(yīng)于TCRa鏈可變區(qū)的序列的一 條序列與對應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合;第二多肽，其中對應(yīng)于TCRi3 鏈可變區(qū)序列的一條序列與對應(yīng)于TCRi3鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合;該第一 和第二多肽通過在天然αβΤ細胞受體中沒有等價物的二硫鍵相連。
[0054] 所述第一多肽可含有與對應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的的Ν末端相融合的 TCRa鏈可變區(qū)序列，而第二多肽中對應(yīng)于TCRi3鏈可變區(qū)序列的一條序列與對