茶多酚或EGCG與β-CD包合物及制備富含茶多酚或EGCG的通用固體培養(yǎng)基的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種茶多酚或EGCG與β-CD包合物及其用于制備富含茶多酚或EGCG的適合真菌培養(yǎng)的通用固體培養(yǎng)基的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]茯磚茶屬于黑茶?！鞍l(fā)花”是其加工工藝流程的特有工序。簡(jiǎn)單的說(shuō)，發(fā)花就是控制一定的溫濕度環(huán)境，使茶磚內(nèi)部經(jīng)歷復(fù)雜微生物生長(zhǎng)的過(guò)程。該過(guò)程經(jīng)歷大約三周左右，是茯磚茶獨(dú)特風(fēng)味品質(zhì)形成的關(guān)鍵時(shí)期。發(fā)花后的茶磚內(nèi)部能看到許多金黃色的小點(diǎn)，這些金黃色的小點(diǎn)是俗稱“金花”的真菌【冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)】。據(jù)報(bào)道，茯磚茶發(fā)花過(guò)程中出現(xiàn)的微生物不僅有冠突散囊菌，還有很多其它真菌，包括徳巴利酵母屬(Debaryomyces spp.)，曲霉屬(Aspergillus spp.)，輪枝抱屬(Verticilliumspp.)，畢赤酵母屬(Pichia spp.);擬盤多毛孢屬(Pestalot1psis spp.)等。冠突散囊菌是其中的優(yōu)勢(shì)菌種之一。
[0003]多年來(lái)的實(shí)踐告訴人們，茯磚茶不僅有獨(dú)特的風(fēng)味，還具有很好的治療菌痢、減月巴、降血脂和助消化等功效。尤其重要的是，近年來(lái)的相關(guān)藥理研究發(fā)現(xiàn)茯磚茶的這些功效與“發(fā)花”有關(guān)。所以，利用微生物對(duì)茶葉原有內(nèi)含成分((即主要的活性物質(zhì)茶多酚類，包括最主要的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯即EGCG，及其它幾種兒茶素類))進(jìn)行發(fā)酵，制備其代謝產(chǎn)物，不僅是研究這些微生物的代謝機(jī)制的基礎(chǔ)，還是今后相關(guān)制藥和保健品行業(yè)的一項(xiàng)重要技術(shù)，在科研領(lǐng)域和產(chǎn)業(yè)方面均具有重要意義。
[0004]比較高效的發(fā)酵模式是利用真菌在富含茶多酚，或者是富含EGCG的固體培養(yǎng)基上發(fā)酵。這種發(fā)酵方法的優(yōu)勢(shì)是:第一，微生物在固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)環(huán)境與茶葉上相似，其代謝機(jī)制才可以相同，即能產(chǎn)生與茯磚茶(或其它黑茶)相同的兒茶素活性衍生物;第二，現(xiàn)代微生物學(xué)研究可提示我們，茯磚茶發(fā)花階段中結(jié)構(gòu)修飾的機(jī)制很有可能是若干種真菌在共生群落的狀態(tài)下才可發(fā)生。在固體培養(yǎng)基上的不同位置接種微生物后，可以發(fā)現(xiàn)不同種類的微生物間如何產(chǎn)生互動(dòng)，分別研究不同的微生物之間產(chǎn)生哪些代謝產(chǎn)物，在測(cè)定這些產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能后，可以篩選出高效生產(chǎn)某活性物質(zhì)的菌種。這在將來(lái)茶葉活性物質(zhì)的產(chǎn)業(yè)發(fā)展和基礎(chǔ)研究中都有重要意義;第三，獲取培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物時(shí)，沒(méi)有茶葉中其它雜質(zhì)(如葉綠素、脂類、黃酮類等)的干擾，便于產(chǎn)物的純化。
[0005]但是作為固體培養(yǎng)基的關(guān)鍵配方之一的瓊脂，只要接觸到茶多酚類物質(zhì)，即無(wú)法凝固，所以目前國(guó)內(nèi)外利用微生物研究茶葉活性產(chǎn)物的技術(shù)主要是液體發(fā)酵，即讓真菌在含有茶多酚的液體培養(yǎng)基中對(duì)這些茶多酚進(jìn)行代謝和修飾，接著從發(fā)酵液中提取和分離出代謝產(chǎn)物。但是這種發(fā)酵方式顯然不具備固體發(fā)酵的第一、第二種優(yōu)勢(shì)。所以目前尚未有報(bào)道證明微生物液體發(fā)酵可以得到與黑茶中活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)相同的產(chǎn)物。這使得該技術(shù)始終停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，無(wú)法產(chǎn)生更高的科研價(jià)值和生產(chǎn)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明的目的之一是提供一種茶多酚或EGCG與β-⑶包合物，其制備方法包括以下步驟:
[0007]1)、制備β-⑶飽和溶液
[0008]取經(jīng)重結(jié)晶后的純?chǔ)?⑶，置燒杯中，加蒸餾水，在60± 1°C條件下制成飽和水溶液，保溫，備用；
[0009]2)、稱取茶多酚或EGCG，所稱取的茶多酚或EGCG與前述β-CD的摩爾比例均為1:1，將稱取得到的茶多酚或EGCG溶于無(wú)水乙醇中得到第一次混合溶液，再將第一次混合溶液逐滴加入到步驟1)制備的β-CD飽和溶液中得到第二次混合溶液，將第二次混合溶液在60°C條件下攪拌若干小時(shí)，然后4°C靜置過(guò)夜，再將其置于冷凍干燥器中冷凍干燥，即制得包合物粗品；取包合物粗品粉末，用甲醇沖洗所述包合物粗品粉末，并將沖洗后的包合物粗品粉末進(jìn)行蒸干，即可制得茶多酚與⑶包合物⑶TP或EGCG與β-⑶包合物⑶TE。
[0010]優(yōu)選的，步驟2)中，將第二次混合溶液在60°C條件下置于磁力攪拌器上磁力攪拌4h0
[0011]優(yōu)選的，步驟2)中，所述冷凍干燥器為真空冷凍干燥器，冷凍溫度為-80°c。
[0012]優(yōu)選的，步驟2)中，所述茶多酚或EGCG與無(wú)水乙醇的摩爾比例為7:85。
[0013]優(yōu)選的，步驟2)中，所述包合物粗品粉末與沖洗用甲醇之間摩爾比例為(1?3):
62ο
[0014]本發(fā)明的目的之二是提供了一種富含茶多酚或EGCG的適合真菌培養(yǎng)的通用固體培養(yǎng)基的制備方法，本制備方法所制得的固體培養(yǎng)基中富含茶多酚或EGCG，從而能夠?yàn)楣谕簧⒛揖日婢峁┡c茶葉相似的固體發(fā)酵環(huán)境。本發(fā)明為研究微生物對(duì)茶多酚的代謝的研究和生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，具有較高的科研價(jià)值。
[0015]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:稱取一定量的PDA培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌處理，并冷卻至60°C待用；將包合物⑶TP或包合物⑶TE進(jìn)行微波滅菌lmin，待用；在已滅菌處理的培養(yǎng)皿中分別加入所述20mL PDA，加入0.4500g⑶TP或⑶TE，用已滅菌處理的玻璃棒攪拌，使其均勻混合在Η)Α中，待冷卻，即制得富含茶多酚培養(yǎng)基CDTP-PDA或富含EGCG培養(yǎng)基CDTE-PDA。
[0016]本發(fā)明的有益效果在于:
[0017]1)、天然環(huán)糊精(07010(1611:1'；[11，0))是環(huán)狀低聚糖，是由€[-1，4糖苷鍵連接0-( + )-吡喃葡萄糖形成的，具有“內(nèi)疏水，外親水”的環(huán)狀特征結(jié)構(gòu)，其疏水空腔可包合許多無(wú)機(jī)、有機(jī)化合物，能改善客體分子的物理化學(xué)性質(zhì)，如降低客體分子的氧化性、鈍化熱敏性、增加客體分子的水溶性等。因此，CD被廣泛的用于工業(yè)生產(chǎn)中。廣泛應(yīng)用的環(huán)糊精有α-CD、β-CD、γ-CD，分別由六，七，和八個(gè)D_( + )_吡喃葡萄糖單位組成，其中β-⑶由于其大小適當(dāng)?shù)膬?yōu)越內(nèi)部空腔，應(yīng)用最廣泛。
[0018]本發(fā)明成功地利用β-⑶疏水空腔的包合性，對(duì)茶多酚或是EGCG進(jìn)行包合，再將包合產(chǎn)物加入培養(yǎng)基中形成富含茶多酚或EGCG的固體培養(yǎng)基，為后期研究微生物對(duì)茶多酚的代謝的研究和生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，也為制備與黑茶中活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)相同的產(chǎn)物提供了可能，本發(fā)明還為有效開發(fā)利用茯磚茶以及其他茶葉提供了廣闊的前景。
[0019]2)、本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，制備條件溫和，不但有利于降低制備成本，而且具有較大的科研推廣價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為⑶TP的TLC結(jié)果(254nm紫外光下檢測(cè))，圖1中標(biāo)號(hào)含義為1: β_⑶，2:⑶ΤΡ，3:茶多酚，4:α-淀粉酶酶解后的CDTP，5:a-淀粉酶酶解后的茶多酚。
[0021]圖2 為1H-NMR譜圖，圖 2 中(a)為β-CD (3.0 X 10—3M)，( b)為CDTP (3.0 X 10—3M)。
[0022]圖3A、3B為CDTE的TLC結(jié)果，其中圖3A為254nm紫外光下檢測(cè)結(jié)果；圖3B為噴灑FeCl3乙醇溶液顯色結(jié)果，圖3A、3B中標(biāo)號(hào)含義為1:β-⑶，2:⑶ΤΕ，3: EGCG，4: α-淀粉酶酶解后的CDTE，5: α-淀粉酶酶解后的EGCG。
[0023]圖4為1H-NMR譜圖(δ3.65-4.15)，圖4中(a)為f3-CD(3.0X10—3M)，(b)為CDTE(3.0X10—3M)o
[0024]圖5為1H-匪R譜圖(δ2.8-7.3):圖5中(a)為EGCG(3.0X10—3M)，(b)為CDTE(3.0 X10—3M)o
[0025]圖6-1A至圖6-3B為PDA培養(yǎng)效果與⑶TP-PDA培養(yǎng)效果的比較圖。其中圖6-1A、圖6-2A、圖6-3A為PDA培養(yǎng)效果圖，圖6-1B、圖6-2B、圖6-3B為CDTP-PDA培養(yǎng)效果圖。
[0026]圖7-1A至圖7-3B為PDA培養(yǎng)效果與⑶ΤΕ-PDA培養(yǎng)效果的比較圖。其中圖7-1A、圖7-2A、圖7-3A為PDA培養(yǎng)效果圖，圖7-1B、圖7-2B、圖7-3B為CDTE-PDA培養(yǎng)效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。
[0028]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0029]下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
[0030]實(shí)施例1
[0031 ] 茶多酸與環(huán)糊精β-Ο)的包合物的制備(!1101毅嫩:1]101￡!—0)= 1:1)
[0032]1.1制備β-⑶飽和溶液
[0033]取經(jīng)重結(jié)晶后的純?chǔ)?⑶8.00g，置燒杯中，加蒸餾水1OOmL，在60 ± 1 °〇條件下制成飽和水溶液，保溫，備用。
[0034]1.2制備包合物
[0035]稱取茶多酚樣品6.17g，溶于5mL的無(wú)水乙醇中，再逐滴加入到2.1制備的β-⑶飽和溶液中，置磁力攪拌器上(60°C條件下)磁力攪拌4h，4°C靜置過(guò)夜(12h)，再將其置于真空冷凍干燥器(溫度為_80°C)中冷凍干燥，即制得包合物粗品。取適量的包合物粉末，用適量的甲醇沖洗粉末，并將包合物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸干，制得茶多酚與β-CD包合物(β-cyclodextrin tea polyphenol，CDTP)，備用。
[0036]1.3CDTP 的表征
[0037]1.3.1薄層色譜表征(thin layer chromatography,TLC)
[0038]圖1所示實(shí)驗(yàn)樣品1-5的處理方法:分別取1、2、3樣品適量，于適量蒸餾水中溶解，作為樣品1-3 ；分別取0.1444g茶多酚、0.1505g⑶TP，各用8mL蒸餾水溶解后，在恒溫水浴鍋中加熱至50 土 2°C，保溫5min，再各加入1.0Oga-淀粉酶，在恒溫水浴中反應(yīng)2h，冷卻至室溫，各加入2mL乙酸乙酯萃取lOmin，取乙酸乙酯層，分別作為樣品4和5。將樣品1-5進(jìn)行硅膠薄層實(shí)驗(yàn)(流動(dòng)相:苯-甲酸乙酯-甲酸= 3-6-1)，觀察色譜展開后的斑點(diǎn)位置并分析結(jié)果。
[0039]由圖1可知，1、2樣品的TLC結(jié)果均未見斑點(diǎn)，說(shuō)明茶多酚與β-CD形成了包合物;3、
4、5樣品的TLC結(jié)果均可見斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)位置相當(dāng)，這表明茶多酚不僅被β-CD包合了，且其性質(zhì)未被改變;包合物中的茶多酚經(jīng)淀粉酶酶解后被釋放，且α-淀粉酶不會(huì)影響茶多酚的性質(zhì)。TLC結(jié)果說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)成功制備了 CDTP。
[0040]1.3.2核磁共振譜表征
[0041 ]核磁共振譜樣品的處理方法:樣品分別溶于500yL D20中，濃度均為3.0 X 10—3M，核磁檢測(cè)溫度為35°C。
[0042]圖2顯示⑶TP中β