越南槐內(nèi)生真菌trxy-46在防治三七黑斑病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種越南槐內(nèi)生真菌TRXY-46在防治三七黑 斑病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對植物病害的防治過度依賴于化學(xué)農(nóng)藥的使用，大量化學(xué)農(nóng)藥的施放不 僅對生態(tài)環(huán)境具有長期的破壞作用，也引起農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降，農(nóng)藥殘留超標、病原菌的耐藥 性以及對人畜有害等諸多問題。尋找更為安全、有效的病害防治方法具有重大的意義，利用 生物的方法來防治植物病害可以有效解決上述問題。
[0003]三七(Panax notoginseng F.H.chen)又名田七、金不換等，具有顯著的活血化瘀、 消腫定痛功效，是一種中國傳統(tǒng)名貴藥材。以三七為主要原料制成的中成藥如"云南白藥" 和"片仔癀"等廣為流傳。近年來，對三七原材料的需求日益增長。但是栽培過程中的真菌病 害嚴重影響了三七生長。目前，在三七種植上，防治真菌病害過度依賴化學(xué)農(nóng)藥，大量化學(xué) 農(nóng)藥的使用不僅影響了三七的品質(zhì)，也造成了三七藥材的大量農(nóng)藥殘留。
[0004] 三七黑斑病能侵染三七植株和地下根系，以莖、葉、花軸受害較重，根部感染后呈 褐色濕腐狀，四季均可發(fā)生，三七園棚內(nèi)溫度高、濕度大，施肥不當(dāng)都有可能使病害蔓延加 重，一般常年發(fā)病率在5%-20%之間，嚴重時高達60%以上。其癥狀大都由三七黑斑病菌 Alternaria panax Whetzel(簡稱A.panax)危害所致。
[0005] 這個真菌病害是造成多年來三七產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量下降的主要原因之一。在廣西三 七的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，由于低海拔及高溫多濕的氣象條件，這種病害往往是同時發(fā)生的，造成 了三七的大量減產(chǎn)甚至絕收，給種植戶帶來了巨大的經(jīng)濟損失。為了控制這個真菌病害，大 量的化學(xué)農(nóng)藥被使用，造成了三七產(chǎn)品的大量農(nóng)藥殘留，嚴重的污染了環(huán)境，大大的威脅了 人們的健康。因此，開展生物防治三七真菌病害對三七產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展是非常迫切和必 要的。為此篩選出能同時拮抗這種病害的拮抗菌具有重大意義，篩選進而開發(fā)利用拮抗菌 也是有效控制三七真菌病害最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐未胧┲弧?br>[0006] 公開于該【背景技術(shù)】部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng) 當(dāng)被視為承認或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種越南槐內(nèi)生真菌TRXY-46在防治三七黑斑病中的應(yīng) 用，從而能有效的防治三七種植過程中出現(xiàn)的三七黑斑病，從而提高三七的產(chǎn)量以及質(zhì)量。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：
[0009]-種越南槐內(nèi)生真菌TRXY-46，越南槐內(nèi)生真菌TRXY-46的分類命名為 Rhexocercosporidium sp.TRXY-46,菌株的ITS序列如SEQ ID N0.1所述，保藏單位：中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中 國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期：2014年12月03日，保藏號:CGMCC No. 10108。
[0010] 優(yōu)選的是，所述越南槐內(nèi)生真菌TRXY-46代謝產(chǎn)物的制備方法為：
[0011] (1)將越南槐內(nèi)生真菌TRXY-46接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平面皿(PDA平板） 中，置于溫度為28°C下培養(yǎng)20天，所得培養(yǎng)材料切成塊狀并轉(zhuǎn)移到無菌固體培養(yǎng)基中，置于 28°C發(fā)酵60天；
[0012] (2)發(fā)酵完成后，用發(fā)酵物2倍的甲醇浸泡發(fā)酵物并超聲40min，然后過濾；
[0013] (3)重復(fù)步驟(2)兩次，合并兩次濾液進行減壓濃縮成浸膏，得到內(nèi)生真菌TRXY-46 發(fā)酵物的甲醇粗提物，即為越南槐內(nèi)生真菌TRXY-46代謝產(chǎn)物。
[0014] 優(yōu)選的是，步驟（1)中所述的無菌固體培養(yǎng)基含400g馬鈴薯，20g的右旋糖和20g蔗 糖。
[0015] 如上述制備所得越南槐內(nèi)生真菌TRXY-46的代謝產(chǎn)物在防治三七黑斑病中的應(yīng) 用。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0017]本發(fā)明首次從藥用植物越南槐的根中分離篩選到一株內(nèi)生真菌 (Rhexocercosporidium sp.)TRXY-46,該菌對三七黑斑病菌具有很強的抑制作用，為三七 真菌病害的生物防治領(lǐng)域帶來廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明越南槐內(nèi)生真菌TRXY-46與三七黑斑病的平板對峙培養(yǎng)，其中F為三 七黑斑病菌(AlternariapanaxWhetzel)，a為空白對照，b為實驗組。
[0019] 圖2是本發(fā)明越南槐內(nèi)生真菌TRXY-46菌株形態(tài)特征。
[0020]圖3為越南槐內(nèi)生真菌TRXY-46菌株基于ITS序列的系統(tǒng)進化樹。
[00211圖4是根據(jù)本發(fā)明菌株越南槐內(nèi)生真菌TRXY-46的代謝產(chǎn)物對三七黑斑病菌的菌 絲生長的抑制效果;其中第1、第5個為空白對照即不含藥的PDA平板;第2、第3、第4個為陽性 對照多菌靈粉劑;第6、第7、第8為菌株的代謝產(chǎn)物，且濃度分別為2mg/ml，4mg/ml，8mg/ml;L 為三七黑斑病菌AlternariapanaxWhetz0
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合【具體實施方式】進行詳細描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護范圍并不受具體 實施方式的限制。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施 例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。甲醇為市購分析純甲醇。 2XTagMasterMix購自寶生物工程有限公司（Takara)，Primer_l、Primer_2由華大基因合 成。
[0023] 實施例1
[0024]菌株的分離、篩選及鑒定
[0025] 一、菌株的分離
[0026]供試材料:采自廣西天等縣石灰?guī)r地區(qū)的野生越南槐。
[0027]供試菌株:由廣西大學(xué)植物病理研究所提供。
[0028]培養(yǎng)基：1000ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基），Η)Α培養(yǎng)基含馬鈴薯300g、 葡萄糖20g、瓊脂20g和氯霉素0.1g，培養(yǎng)基pH值為6.0 ± 0.2。
[0029] 表面消毒:將長為6-8cm、寬為l-2cm新鮮健康的越南槐根用流水沖洗30min以沖干 凈泥沙，然后將洗凈的越南槐根用無菌水漂洗2次，風(fēng)干表面水分，移到超凈工作臺，在無菌 條件下，將越南槐根用體積濃度為75%乙醇浸泡lmin，無菌水漂洗2次，次氯酸鈉(有效氯 1 % )浸泡2min，無菌水洗3次，無菌吸水紙吸干表面?zhèn)溆谩?br>[0030]菌株的分離、純化:表面消毒好的越南槐根，無菌條件下，用無菌木片刮去表皮，用 無菌枝剪剪去越南槐根的兩端，余下部分用無菌小刀和無菌鑷子分開木質(zhì)部和韌皮部，并 用無菌枝剪剪成0.5cm長的組織塊，無菌轉(zhuǎn)接至制備好的TOA培養(yǎng)基(含氯霉素），28°C培養(yǎng)。 取表面消毒最后一次漂洗液涂布在PDA平板上，作為陰性對照。每天觀測，待組織周圍長出 菌絲，挑取單一菌絲，接于無抗生素的PDA培養(yǎng)基。長出的菌落，如果菌落形態(tài)不一致，繼續(xù) 挑取單一菌絲轉(zhuǎn)接PDA培養(yǎng)基，直至平板上新長出的菌落的外部形態(tài)一致。
[0031] 將分離到的內(nèi)生真菌接種于PDA平板內(nèi)，28°C下培養(yǎng)20天后待用。將三七黑斑病菌 接種于PDA平板，28°C下培養(yǎng)3天后待用。
[0032]二、篩選
[0033]采用平板對峙法對供試越南槐內(nèi)生真菌進行菌體抑菌活性的初篩。
[0034]首先，無菌條件下，用滅菌打孔器將內(nèi)生真菌和三七黑斑病菌制成6mm菌餅;在處 理組中，將內(nèi)生真菌菌餅轉(zhuǎn)接到含TOA的培養(yǎng)皿中央，然后在內(nèi)生真菌的菌餅周圍等徑3cm 處放置三七黑斑病菌菌餅，每株內(nèi)生真菌重復(fù)3皿;在對照組中，PDA的培養(yǎng)皿中央不接內(nèi)生 真菌菌餅，在PDA的培養(yǎng)皿中央周圍等徑3cm處放置三七黑斑病菌菌餅，重復(fù)3皿。然后28°C 下培養(yǎng)，定期觀測。待對照組中菌絲長至Η)Α的培養(yǎng)皿平板中央，在處理組中，測量三七黑斑 病菌菌餅中心到內(nèi)生真菌菌餅中心之間三七黑斑病菌的生長半徑為處理生長半徑;在對照 組中，測量三七黑斑病菌菌餅中心到PDA的培養(yǎng)皿中心之間三七黑斑病菌的生長半徑為對 照生長半徑。最后，根據(jù)以下公式，計算抑菌率：
[0035] 對照生長量=對照生長半徑-菌餅半徑 [0036]處理生長量=處理生長半徑-菌餅半徑
[0038]結(jié)果共得到4株對三七黑斑病菌抑制作用都很強的拮抗越南槐內(nèi)生真菌菌株，其 中一株名稱為TRXY-46,對三七黑斑病菌的抑制率為81%。
[0039]三、鑒定[0040](一)菌株形態(tài)特征
[00411菌體形態(tài)特征觀察:將待鑒定的內(nèi)生菌真菌菌株TRXY-46接種在PDA培養(yǎng)基上，置 于28°C培養(yǎng)，分別在5、14及20天觀察其培養(yǎng)特征和顏色變化。取穩(wěn)定成熟的顏色特征作為 其培養(yǎng)特征，作為鑒定的依據(jù)。觀察記錄氣生菌絲的顏色，菌落的大小、顏色、組織形狀、表 面形狀等作為參考特征。
[0042]孢子形態(tài)特征觀察:將待鑒定的內(nèi)生菌真菌菌株TRXY-46作插片培養(yǎng)，當(dāng)在PDA培 養(yǎng)基上不產(chǎn)孢子，將菌絲轉(zhuǎn)接于含無菌越南槐根的低營養(yǎng)培養(yǎng)基（四分之一濃度roA)上以 誘導(dǎo)孢子，將所觀察到的形態(tài)結(jié)果顯微照相，如圖2所示。
[0043] (二)菌株ITS序列及其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析
[0044]DNA模板的制備：
[0045]試劑：（1)裂解緩沖液：Tris-Ac(pH 7.8)40mM，NaAc 20mM，EDTA lmM，SDS l%(w/ v)；
[0046](2)δΜNaCl溶液。
[0047]DNA提?。?br>[0048]加600yL65°C預(yù)熱的提取液（Tris-Ac(pH7.8)40mM，NaAc20mM，EDTAlmM，SDS 1 % )到1.5ml離心管(EP管），用棒刮取少量菌絲放入EP管研磨，65°C水浴30min，離心轉(zhuǎn)速 12000r/min，離心lOmin;
[0049]取離心所得上清液400yL，加5MNaCLlOOyL，冰浴lOmin;
[0050]然后在溫度為4°C下保持離心轉(zhuǎn)速為12000r/min，離心lOmin，取上清液;加上清液 〇 . 6倍異丙醇與上清液混勻（或2倍無水乙醇）冰浴1h，保持離心轉(zhuǎn)速12000r/miη，離心 lOmin，棄去上清液后所得余下物質(zhì)晾干，加20yL雙蒸水(ddH20)，取l-2yL做DNA模板。
[0051]PCR擴增ITS序列：
[0052] (l)PCR儀：ABI 3730-XL DNA測序儀（Applied Biosystems,USA)
[0053] (2)擴增引物dTSUS'-T CCGTAGGTGAACCTGCG G-3')如SEQ ID N0.2 所示，和ITSMS'-T CCTCCGCTTATTGATATG