越南槐內(nèi)生真菌sdte-p在防治三七黑斑病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種越南槐內(nèi)生真菌SDTE-P在防治三七黑斑 病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對(duì)植物病害的防治過(guò)度依賴(lài)于化學(xué)農(nóng)藥的使用，大量化學(xué)農(nóng)藥的施放不 僅對(duì)生態(tài)環(huán)境具有長(zhǎng)期的破壞作用，也引起農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降，農(nóng)藥殘留超標(biāo)、病原菌的耐藥 性以及對(duì)人畜有害等諸多問(wèn)題。尋找更為安全、有效的病害防治方法具有重大的意義，利用 生物的方法來(lái)防治植物病害可以有效解決上述問(wèn)題。
[0003] 三七(PanaxnotoginsengF.H.chen)又名田七、金不換等，具有顯著的活血化瘀、 消腫定痛功效，是一種中國(guó)傳統(tǒng)名貴藥材。以三七為主要原料制成的中成藥如"云南白藥" 和"片仔癀"等廣為流傳。近年來(lái)，對(duì)三七原材料的需求日益增長(zhǎng)。但是栽培過(guò)程中的真菌病 害嚴(yán)重影響了三七生長(zhǎng)。目前，在三七種植上，防治真菌病害過(guò)度依賴(lài)化學(xué)農(nóng)藥，大量化學(xué) 農(nóng)藥的使用不僅影響了三七的品質(zhì)，也造成了三七藥材的大量農(nóng)藥殘留。
[0004] 三七黑斑病能侵染三七植株和地下根系，以莖、葉、花軸受害較重，根部感染后呈 褐色濕腐狀，四季均可發(fā)生，三七園棚內(nèi)溫度高、濕度大，施肥不當(dāng)都有可能使病害蔓延加 重，一般常年發(fā)病率在5%-20%之間，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)60%以上。其癥狀大都由三七黑斑病菌 AlternariapanaxWhetzel(簡(jiǎn)稱(chēng)A.panax)危害所致。
[0005]這個(gè)真菌病害是造成多年來(lái)三七產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量下降的主要原因之一。在廣西三 七的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，由于低海拔及高溫多濕的氣象條件，這種病害往往是同時(shí)發(fā)生的，造成 了三七的大量減產(chǎn)甚至絕收，給種植戶(hù)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了控制這個(gè)真菌病害，大 量的化學(xué)農(nóng)藥被使用，造成了三七產(chǎn)品的大量農(nóng)藥殘留，嚴(yán)重的污染了環(huán)境，大大的威脅了 人們的健康。因此，開(kāi)展生物防治三七真菌病害對(duì)三七產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展是非常迫切和必 要的。為此篩選出能同時(shí)拮抗這種病害的拮抗菌具有重大意義，篩選進(jìn)而開(kāi)發(fā)利用拮抗菌 也是有效控制三七真菌病害最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐未胧┲弧?br>[0006]公開(kāi)于該【背景技術(shù)】部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng) 當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種越南槐內(nèi)生真菌SDTE-P在防治三七黑斑病中的應(yīng)用， 從而能有效的防治三七種植過(guò)程中出現(xiàn)的三七黑斑病，從而提高三七的產(chǎn)量以及質(zhì)量。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：
[0009] 一種越南槐內(nèi)生真菌SDTE-P，越南槐內(nèi)生真菌SDTE-P的分類(lèi)命名為橘青霉 (Penicilliumcitrinum)SDTE_P，菌株的ITS序列如SEQIDN0.1所述，保藏單位：中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó) 科學(xué)院微生物研究所，保藏日期:2015年05月13日，保藏號(hào):CGMCCNo.10808。
[0010]優(yōu)選的是，所述越南槐內(nèi)生真菌SDTE-Ρ代謝產(chǎn)物的制備方法為：
[0011] (1)將越南槐內(nèi)生真菌SDTE-Ρ接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平面皿(PDA平板） 中，置于溫度為28°C下培養(yǎng)10天，所得培養(yǎng)材料切成塊狀并轉(zhuǎn)移到無(wú)菌固體培養(yǎng)基中，置于 28°C發(fā)酵40天；
[0012] (2)發(fā)酵完成后，用發(fā)酵物2倍的甲醇浸泡發(fā)酵物并超聲40min，然后過(guò)濾；
[0013] (3)重復(fù)步驟(2)兩次，合并兩次濾液進(jìn)行減壓濃縮成浸膏，得到內(nèi)生真菌SDTE-P 發(fā)酵物的甲醇粗提物，即為越南槐內(nèi)生真菌SDTE-Ρ代謝產(chǎn)物。
[0014] 優(yōu)選的是，步驟（1)中所述的無(wú)菌固體培養(yǎng)基含400g馬鈴薯，20g的右旋糖和20g蔗 糖。
[0015]如上述制備所得越南槐內(nèi)生真菌SDTE-Ρ的代謝產(chǎn)物在防治三七黑斑病中的應(yīng)用。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0017] 本發(fā)明首次從藥用植物越南槐的根中分離篩選到一株內(nèi)生真菌（Penicillium citrinum)SDTE-P，該菌對(duì)三七黑斑病菌具有很強(qiáng)的抑制作用，為三七真菌病害的生物防治 領(lǐng)域帶來(lái)廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1是本發(fā)明越南槐內(nèi)生真菌SDTE-Ρ與三七黑斑病的平板對(duì)峙培養(yǎng)，其中F為三七 黑斑病菌(AlternariapanaxWhetzel)，a為空白對(duì)照，b為實(shí)驗(yàn)組。
[0019] 圖2是本發(fā)明越南槐內(nèi)生真菌SDTE-Ρ菌株形態(tài)特征，其中，al為菌落形態(tài)，bl為菌 體形態(tài)。
[0020]圖3為越南槐內(nèi)生真菌SDTE-Ρ菌株基于ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
[0021]圖4是根據(jù)本發(fā)明菌株越南槐內(nèi)生真菌SDTE-Ρ的代謝產(chǎn)物對(duì)三七黑斑病菌的菌絲 生長(zhǎng)的抑制效果;其中第1、第5個(gè)為空白對(duì)照即不含藥的PDA平板;第2、第3、第4個(gè)為陽(yáng)性對(duì) 照多菌靈粉劑;第6、第7、第8為菌株SDTE-Ρ的代謝產(chǎn)物，且濃度分別為2mg/ml，4mg/ml，8mg/ ml;L為三七黑斑病菌AlternariapanaxWhetz。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體 實(shí)施方式的限制。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施 例中所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。甲醇為市購(gòu)分析純甲醇。 2XTagMasterMix購(gòu)自寶生物工程有限公司（Takara)，Primer_l、Primer_2由華大基因合 成。
[0023] 實(shí)施例1
[0024]菌株的分離、篩選及鑒定
[0025] 一、菌株的分離
[0026]供試材料:采自廣西天等縣石灰?guī)r地區(qū)的野生越南槐。
[0027]供試菌株:由廣西大學(xué)植物病理研究所提供。
[0028]培養(yǎng)基：1000ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基），Η)Α培養(yǎng)基含馬鈴薯300g、 葡萄糖20g、瓊脂20g和氯霉素0.1g，培養(yǎng)基pH值為6.0 ± 0.2。
[0029] 表面消毒:將長(zhǎng)為6-8cm、寬為l-2cm新鮮健康的越南槐根用流水沖洗30min以沖干 凈泥沙，然后將洗凈的越南槐根用無(wú)菌水漂洗2次，風(fēng)干表面水分，移到超凈工作臺(tái)，在無(wú)菌 條件下，將越南槐根用體積濃度為75%乙醇浸泡lmin，無(wú)菌水漂洗2次，次氯酸鈉(有效氯 1 % )浸泡2min，無(wú)菌水洗3次，無(wú)菌吸水紙吸干表面?zhèn)溆谩?br>[0030] 菌株的分離、純化:表面消毒好的越南槐根，無(wú)菌條件下，用無(wú)菌木片刮去表皮，用 無(wú)菌枝剪剪去越南槐根的兩端，余下部分用無(wú)菌小刀和無(wú)菌鑷子分開(kāi)木質(zhì)部和韌皮部，并 用無(wú)菌枝剪剪成0.5cm長(zhǎng)的組織塊，無(wú)菌轉(zhuǎn)接至制備好的TOA培養(yǎng)基(含氯霉素），28°C培養(yǎng)。 取表面消毒最后一次漂洗液涂布在PDA平板上，作為陰性對(duì)照。每天觀測(cè)，待組織周?chē)L(zhǎng)出 菌絲，挑取單一菌絲，接于無(wú)抗生素的PDA培養(yǎng)基。長(zhǎng)出的菌落，如果菌落形態(tài)不一致，繼續(xù) 挑取單一菌絲轉(zhuǎn)接PDA培養(yǎng)基，直至平板上新長(zhǎng)出的菌落的外部形態(tài)一致。
[0031]將分離到的內(nèi)生真菌接種于PDA平板內(nèi)，28°C下培養(yǎng)20天后待用。將三七黑斑病菌 接種于PDA平板，28°C下培養(yǎng)3天后待用。
[0032] 二、篩選
[0033] 采用平板對(duì)峙法對(duì)供試越南槐內(nèi)生真菌進(jìn)行菌體抑菌活性的初篩。
[0034]首先，無(wú)菌條件下，用滅菌打孔器將內(nèi)生真菌和三七黑斑病菌制成6mm菌餅;在處 理組中，將內(nèi)生真菌菌餅轉(zhuǎn)接到含TOA的培養(yǎng)皿中央，然后在內(nèi)生真菌的菌餅周?chē)葟?cm 處放置三七黑斑病菌菌餅，每株內(nèi)生真菌重復(fù)3皿;在對(duì)照組中，PDA的培養(yǎng)皿中央不接內(nèi)生 真菌菌餅，在PDA的培養(yǎng)皿中央周?chē)葟?cm處放置三七黑斑病菌菌餅，重復(fù)3皿。然后28°C 下培養(yǎng)，定期觀測(cè)。待對(duì)照組中菌絲長(zhǎng)至Η)Α的培養(yǎng)皿平板中央，在處理組中，測(cè)量三七黑斑 病菌菌餅中心到內(nèi)生真菌菌餅中心之間三七黑斑病菌的生長(zhǎng)半徑為處理生長(zhǎng)半徑;在對(duì)照 組中，測(cè)量三七黑斑病菌菌餅中心到PDA的培養(yǎng)皿中心之間三七黑斑病菌的生長(zhǎng)半徑為對(duì) 照生長(zhǎng)半徑。最后，根據(jù)以下公式，計(jì)算抑菌率：
[0035]對(duì)照生長(zhǎng)量=對(duì)照生長(zhǎng)半徑-菌餅半徑[0036]處理生長(zhǎng)量=處理生長(zhǎng)半徑-菌餅半徑
[0038]結(jié)果共得到4株對(duì)三七黑斑病菌抑制作用都很強(qiáng)的拮抗越南槐內(nèi)生真菌菌株，其 中一株名稱(chēng)為SDTE-P，對(duì)三七黑斑病菌的抑制率為56%。
[0039]三、鑒定[0040](一)菌株形態(tài)特征
[00411菌體形態(tài)特征觀察:將待鑒定的內(nèi)生菌真菌菌株SDTE-P接種在PDA培養(yǎng)基上，置于28°C培養(yǎng)，分別在5、14及20天觀察其培養(yǎng)特征和顏色變化。取穩(wěn)定成熟的顏色特征作為其 培養(yǎng)特征，作為鑒定的依據(jù)。觀察記錄氣生菌絲的顏色，菌落的大小、顏色、組織形狀、表面 形狀等作為參考特征。
[0042]孢子形態(tài)特征觀察:將待鑒定的內(nèi)生菌真菌菌株SDTE-P作插片培養(yǎng)，當(dāng)在PDA培養(yǎng) 基上不產(chǎn)孢子，將菌絲轉(zhuǎn)接于含無(wú)菌越南槐根的低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（四分之一濃度roA)上以誘 導(dǎo)孢子，將所觀察到的形態(tài)結(jié)果顯微照相，如圖2所示。
[0043](二)菌株ITS序列及其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析
[0044] DNA模板的制備：
[0045]試劑：（1)裂解緩沖液：Tris-Ac(pH7.8)40mM，NaAc20mM，EDTAlmM，SDSl%(w/ v)；
[0046](2)δΜNaCl溶液。
[0047] DNA提取：
[0048]加600yL提取液（Tris-Ac(pH7.8)40mM，NaAc20mM，EDTAlmM，SDS1%)到 1.5ml 離心管(EP管），用棒刮取少量菌絲放入EP管研磨，65°C水浴30min，離心轉(zhuǎn)速12000r/min，離 心lOmin;
[0049] 取離心所得上清液400yL，加5MNaCLlOOyL，冰浴lOmin;
[0050] 然后在溫度為4°C下保持離心轉(zhuǎn)速為12000r/min，離心lOmin，取上清液;加上清液 〇 . 6倍異丙醇與上清液混勻（或2倍無(wú)水乙醇）冰浴1h，保持離心轉(zhuǎn)速12000r/miη，離心 lOmin，棄去上清液后所得余下物質(zhì)晾干，加20yL雙蒸水(ddH20)，取l-2yL做DNA模板。
[0051] PCR擴(kuò)增ITS序列：
[0052] (l)PCR儀:ABI3730-XLDNA測(cè)序儀(AppliedBiosystems,USA);
[0053] (2)擴(kuò)增引物dTSUS'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')如SEQID N0.2 所示，和ITSM