一種產(chǎn)堿性脂肪酶的黑曲霉突變菌株的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種產(chǎn)堿性脂肪酶的黑曲霉突變菌株。 技術背景
[0002] 脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性 酯類的水解、醇解、酯化、轉酯化及酯類的逆向合成反應，除此之外還表現(xiàn)出其他一些酶的 活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶具有廣泛的應用價 值，已成為市場上的第三大工業(yè)用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應，廣泛應 用于飼料添加劑、油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)。
[0003]堿性脂肪酶是在堿性條件下水解的脂肪酶，生產(chǎn)的主要原料為小麥、玉米等農(nóng)副 產(chǎn)物，通過生物發(fā)酵技術轉化。它可以水解天然油脂，生產(chǎn)脂肪酸和甘油，是一種專門在異 相系統(tǒng)油水接口上水解特殊酯類的酶。
[0004]目前堿性脂肪酶主要應用于洗滌劑行業(yè)，單獨或與堿性蛋白酶一起添加在洗滌劑 中，作為洗滌劑的一種添加成分，它有助于脂肪油漬和人體皮脂污垢的去除。1988年，丹麥 NoVo公司報道了堿性脂肪酶在洗滌劑中的應用，并將其投入到工業(yè)化生產(chǎn)中。日本獅子油 脂公司同年也推出了加脂肪酶的洗衣粉。P&G公司和聯(lián)合利華公司等中外合資公司也推出 了含脂肪酶和蛋白酶的高檔洗衣粉。國內(nèi)對堿性脂肪酶的研究起步較晚，在堿性脂肪酶發(fā) 酵菌種、提取工藝、酶活性以及顆粒酶制備技術等方面與國外的先進技術有很大的差距，尤 其是產(chǎn)品的生產(chǎn)成本遠高于國外同類產(chǎn)品，缺乏競爭力，所以現(xiàn)在急需開發(fā)堿性脂肪酶高 產(chǎn)菌株，促進堿性脂肪酶的廣泛應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一株產(chǎn)堿性脂肪酶的黑曲霉突變菌株及其應用，是將來源于 疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)的堿性脂肪酶基因轉化入黑曲霉宿主菌 中，構建高效表達堿性脂肪酶的黑曲霉工程菌;然后通過基因敲除手段敲除宿主菌自身的 淀粉酶基因，再篩選獲得堿性脂肪酶產(chǎn)量明顯提高的突變菌株，為該酶的廣泛應用奠定了 基礎。
[0006]本發(fā)明一方面提供了一種黑曲霉工程菌，其攜帶有表達堿性脂肪酶基因的重組質 粒。
[0007] 所述的堿性脂肪酶，其氨基酸序列為SEQIDNO: 1;其編碼基因的序列為SEQID N0:2〇
[0008] 本發(fā)明一方面提供了一株突變菌黑曲霉Su-L2(AspergillusnigerSu-L2)，已于 2015年12月16日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0：M2015761〇
[0009]本發(fā)明所述黑曲霉Su-L2在生產(chǎn)堿性脂肪酶中的應用。
[0010] 本發(fā)明構建的黑曲霉工程菌SU-L1，在30L發(fā)酵罐發(fā)酵條件下其堿性脂肪酶活力達 到10089u/ml，蛋白表達量為4.54g/L。為了進一步提高其產(chǎn)酶能力，本發(fā)明通過基因敲除手 段敲除宿主菌自身的淀粉酶基因，篩選獲得的突變菌株黑曲霉Su-L2,其堿性脂肪酶活力達 到15766u/ml，蛋白表達量為5.4g/L，比突變前分別提高了 56.3 %和18.9 %，有利于該酶的 廣泛應用。
【附圖說明】
[0011]圖1為質粒pGAU圖譜；
[0012]圖 2 為質粒pMD18T-pyrG圖譜。
【具體實施方式】
[0013]本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規(guī)技術和方法，例如 MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL，3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLSINMOLECULARBI0L0GY(Ausubel，2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻 提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，本領域的技術人員可以在本發(fā)明所記載 的技術方案的基礎上，采用本領域其它常規(guī)的方法、實驗方案和試劑，而不限于本發(fā)明具體 實施例的限定。
[0014]下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細描述。
[0015]實施例1堿性脂肪酶基因的獲得
[0016]根據(jù)公共基因數(shù)據(jù)庫中的基因序列，由上海捷瑞公司合成堿性脂肪酶基因LipN (序列為SEQIDN0:2)，其編碼的氨基酸序列為SEQIDN0:1。
[0017] PCR引物和反應條件如下：
[0018]引物1(F) :ATGCGGTCCTCCCTGGTGCTG
[0019]引物2(R) :TCACAGACAGGTGCCGATCAG
[0020] 反應條件為：94°C變性5min;然后94°C變性30s，56°C復性30s，72°C延伸45s，30個 循環(huán)后，72°C保溫10min。瓊脂糖電泳結果顯示，LipN基因大小為876bp。
[0021] 實施例2重組載體構建
[0022] PCR擴增堿性脂肪酶基因，引物兩端引入Xbal位點。引物序列如下：
[0023]引物3(F) ：GCTCTAGAATGCGGTCCTCCCTGGTGCTG
[0024]引物4(R) ：GCTCTAGATCACAGACAGGTGCCGATCAG
[0025]PCR反應條件為：94°C變性5min;然后94°C變性30s，56°C復性30s，72°C延伸45s，30 個循環(huán)后，72°C保溫10min。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，LipN基因為大小876bp的片段。
[0026]將上述獲得的堿性脂肪酶LipN片段與表達載體pGAU分別進行限制性內(nèi)切酶Xbal單酶切，酶切條件如下：
[0028] 37°C水浴酶切處理2h，電泳后分別回收兩個目的片段，溶于20ulddH20。用T4DNA 連接酶進行連接，連接體系如下：
[0030] 22°C連接lh，轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，涂布LB+AMP平板，37°C培養(yǎng)過夜后長出單 菌落，菌落PCR驗證連接正確的轉化子提取質粒送測序，測序正確后，即得到含有堿性脂肪 酶基因LipN的重組載體pGAU-LipN。
[0031]實施例3堿性脂肪酶LipN的重組表達
[0032]原生質體制備:接種黑曲霉宿主Su2-1于PDA+U平板，30°C培養(yǎng)5-7d。割取2cmX2cm大小的菌塊，接種l〇〇ml液體PDA+U培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24h生長菌絲體，用于轉化。將長好的 菌絲體過濾后，用20ml1.2M硫酸鎂溶液重懸，加入0.2g溶菌酶。30°C、lOOrpm培養(yǎng)2-3h。將 裂解好的菌絲用2層擦鏡紙過濾，3000rpm離心lOmin獲得原生質體。
[0033]轉化:原生質體用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用適量的山梨醇溶液重懸，使原生 質體濃度達到1〇8。200ul原生質體中加入10ul準備好的質粒，加入50ul25 %的PEG6000，冰 浴20min，再加入2ml25 %的TOG6000室溫放置5min，加入4ml山梨醇溶液顛倒混勻。倒入 50ml轉化上層培養(yǎng)基后，傾倒入4個轉化下層平板中，待上層培養(yǎng)基凝固后，于30°C培養(yǎng)箱 中倒置培養(yǎng)5d。
[0034] 轉化子篩選:培養(yǎng)5d后，挑取長出的菌落，點種到轉化下層平板進行復篩，30°C培 養(yǎng)2d。將正常生長的轉化子分別接種到新鮮的PDA平板，30°C培養(yǎng)5-7d。每個轉化子割取2cm X2cm大小的菌塊，分別接種50ml液體搖瓶培養(yǎng)基中發(fā)酵，32°C培養(yǎng)5d，每天加入適量氨水， 控制pH在4.5左右。培養(yǎng)5d后，離心菌體獲得上清液即為粗酶液，進行蛋白電泳檢測，篩選出 有明顯蛋白條帶表達的重組菌株即為陽性轉化子。
[0035] 將其中一個陽性轉化子命名為黑曲霉Su_Ll(Aspergillus niger Su_Ll)。
[0036] 實施例4:U缺陷型菌株篩選
[0037] 將上述黑曲霉Su-Ll接種至PDA平板，30°C培養(yǎng)7d，吸取lml無菌水洗脫孢子，稀釋 一定倍數(shù)使孢子濃度在1X1〇5個/ml。涂布BT平板(PDA中添加終濃度1.5g/L的5-氟乳