一株木質纖維素類物質高效降解菌l252及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株木質纖維素類物質高效降解菌L252及其應用。
【背景技術】
[0002] 我國是一個農業(yè)大國，農業(yè)廢棄物產生量極其巨大，由于受經(jīng)濟效益和技術普及 的限制，農業(yè)廢棄物大都粗放低效利用且閑置狀況嚴重，造成資源浪費和環(huán)境污染，廢棄物 已經(jīng)成為中國最大的污染源。而在農業(yè)廢棄物存在著大量的木質纖維素，亟待人們去開發(fā) 利用。
[0003] 木質纖維素是自然界中僅次于纖維素的第二豐富的有機可再生資源，也是微生物 最難降解的成分之一。近年來，某些降解木質素的真菌已開始在實際中得以應用，但仍有待 進一步開發(fā)。木質素微生物降解的應用主要有:造紙工業(yè);飼料工業(yè);發(fā)酵與食品工業(yè);生物 物肥料環(huán)境保護;木素酶的生物漂白技術，等等。
[0004] 目前農業(yè)有機固體廢棄通常通過能源化利用、有機肥料、禽畜飼料、可食用菌培養(yǎng) 基料和工業(yè)原料進行利用。在利用農業(yè)廢棄物的生產實踐中，物理、化學和生物處理方法經(jīng) 常結合使用，而其中生物處理方法尤其是利用微生物處理代表了今后的發(fā)展趨勢。生物方 法就是指利用木質素降解酶去降解木質纖維材料中的木質素，從而使木質素-半纖維素-纖 維素結構解體，纖維素得以暴露出來供后續(xù)步驟處理與傳統(tǒng)的機械、物理化學類法相比，生 物處理法的優(yōu)點是能耗低，所需環(huán)境條件溫和，避免了傳統(tǒng)化學處理、機械處理技術等耗能 較多、存在環(huán)境污染等缺點，從成本和設備角度考慮，生物脫木質素法占有獨特的優(yōu)勢。但 是，目前的生物處理法有一個很大的弱點限制了它的應用，這就是生物處理法中的關鍵角 色-木質素降解酶的活性普遍不高，從而導致處理效率較低，如果能利用基因工程和傳統(tǒng)的 生物技術對菌種和酶進行改造，提高酶活力，降低酶成本，生物法脫木質素法則有望應用于 大規(guī)模工業(yè)生產。
[0005] 而目前應用最廣泛的是微生物菌肥，微生物菌肥作為一種新的農業(yè)技術措施，在 發(fā)展高產、優(yōu)質、高效農業(yè)中的作用逐漸被人們所認識。傳統(tǒng)的微生物肥料己經(jīng)在大面積推 廣應用中，新型的微生物菌肥品種不斷開發(fā)出來。微生物肥是由具有特殊效能的微生物經(jīng) 過發(fā)酵而制成的、含有大量有益微生物、對作物有特定肥效的特定微生物制品。微生物肥料 利用微生物的生命活動，將作物不能吸收利用的物質轉化為可被作物吸收利用的營養(yǎng)物， 改善作物的營養(yǎng)條件，有些兼有刺激作物生長或增強抗病性的作用，以提高作物產量，改 善農產品品質。它既能增加農產品的出日創(chuàng)匯，又具有工農業(yè)有機廢物有效利用、防止環(huán)境 污染、改進土壤結構、提高土壤肥力和保護生態(tài)良性循環(huán)的巨大社會效益和生態(tài)效益。
[0006] 國內的研究大多數(shù)為真菌降解木質纖維素。但是，利用真菌降解木質纖維素普遍 存在酶活力較低的問題。由于細菌繁殖較快，發(fā)酵周期短，可應用于工業(yè)生產，且細菌產生 的纖維素酶一般作用條件為中性或偏堿性，這在制漿、造紙和洗滌劑工業(yè)等污染行業(yè)的廢 水治理上有著潛在的應用前景，因此從細菌中篩選出有效菌株應用于木質纖維素降解具有 一定的實際意義及開發(fā)前景。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的是為了提供一株木質素高效降解菌及其應用。
[0008]本發(fā)明的一株木質素高效降解菌為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院3號，保藏日期為2014年12月12日，保藏號CGMCCNo. 10161。
[0009] 本發(fā)明的一株木質素高效降解菌用于降解木質素上。
[0010] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0011] 本發(fā)明的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252增值迅速，適應性強，應 用廣泛，耐鹽性為鹽濃度8%，耐熱性為50°C;連續(xù)傳代培養(yǎng)10次，菌株生長情況、產酶情況 以及酶活力穩(wěn)定，無退化現(xiàn)象;對袋料木耳廢料和玉米秸桿具有明顯的降解效果，經(jīng)肺炎克 雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252發(fā)酵處理后的袋料木耳廢料的失重率在30%以 上，經(jīng)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252發(fā)酵處理后的玉米猜桿的失重率在 26%以上;具有顯著的木質素降解能力，可以高效降解木質素，經(jīng)復合微生物菌劑發(fā)酵處理 的玉米猜桿中木質素含量是經(jīng)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252發(fā)酵處理的 玉米猜桿中木質素含量的1.3倍，作為單一菌株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae) L252對木質素的降解能力強于復合微生物菌劑;在降解樣品時，不影響樣品中的主要元素 含量，不會導致試樣中的全氮、全磷、全鉀、速效磷和速效鉀含量變化，保存樣品肥效。
[0012] 本發(fā)明從袋料木耳廢料、林間朽木和林間土壤中分離篩選出能夠以木質素為唯一 碳源生長的原始菌株，確定對木質素的降解能力以及種屬關系，為將來復合微生物菌劑構 建奠定基礎。將為我國農業(yè)資源的有效化利用提供有力幫助。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252培養(yǎng)12h后的掃描電 子顯微鏡圖（X20，000);
[0014]圖2為16SrDNA序列PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖其中，1泳道為Maker DL2000，2泳道為菌株L252;
[0015]圖3為回收后的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測圖其中，1泳道為MakerDL2000,2泳 道為菌株L252;
[0016]圖4為陽性克隆子篩選的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖其中，1泳道為MakerDL2000,2泳 道為菌株L252;
[0017] 圖5為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252的系統(tǒng)進化樹；
[0018] 圖6為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252對袋料木耳廢料的 失重率圖；
[0019] 圖7為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252對玉米猜桿的失重 率圖；
[0020] 圖8為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252菌株降解后玉米猜 桿中各組分含量柱狀圖；其中，1為木質素含量柱狀圖；2為纖維素含量柱狀圖；3為半纖維素 含量柱狀圖；
[0021] 圖9為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)L252菌株發(fā)酵處理后玉 米秸桿中全氮全磷和全鉀含量柱狀圖；其中，1為全氮含量柱狀圖；2為全磷含量柱狀圖；3為 全鉀含量柱狀圖；
[0022] 圖10為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)L252菌株發(fā)酵處理后玉 米猜桿中速效磷含量柱狀圖；
[0023] 圖11為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)L252菌株發(fā)酵處理后玉 米猜桿中速效鉀含量柱狀圖。
【具體實施方式】
【具體實施方式】 [0024] 一:本實施方式的一株木質纖維素類物質高效降解菌，它為肺炎克 雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)L252,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2014年12月12日，保藏 號CGMCCN0.10161。
[0025] 本實施方式的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)L252為革蘭氏陰性菌， 該菌株菌體形態(tài)為桿狀，菌體大小為0.57~0.62 X 1.4~1.5μπι，不形成芽孢，無鞭毛，有莢 膜;在LB培養(yǎng)基上形成圓形、不透明、乳白色、突起光滑、邊緣整齊的菌落(如圖1所示）。 [0026]該菌株的生理生化反應結果共18項、28個指標;結合形態(tài)與生理生化反應結果，比 對《伯杰氏細囷鑒定手冊》確定該囷株的種屬，結果如表1所不。
[0027]根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細菌手冊》對分離出的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)L252進行進行革蘭氏染色、氧化酶、接觸酶、焚光色素、甲基紅、 七葉苷溶解、明膠液化、石蕊牛乳胨化及產酸、脂酶、淀粉水解、V.P.測定、檸檬酸鹽利用、纖 維素降解、3_酮基乳糖利用、苯丙氨酸脫氨酶、色氨酸脫氨酶、耐熱熱性、耐鹽性生理生化實 驗的檢測和鑒定。結果表明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)L252為革蘭氏陰性 菌，耐鹽性為鹽濃度8%，耐熱性為50°C，可產生接觸酶，但不能產生氧化酶、脂酶、苯丙氨酸 脫氨酶、色氨酸脫氨酶和熒光色素，甲基紅、檸檬酸鹽利用、石蕊牛乳胨化、七葉苷溶解和石 蕊牛乳產酸表現(xiàn)為陽性，V.P.試驗、淀粉水解、明膠液化、纖維素降解和3-酮基乳糖利用表 現(xiàn)為陰性。
[0028] 表1菌株L252的形態(tài)學特征與生理生化鑒定結果 [0029]
[0031]本實施方式的木質素高效降解菌為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252的篩選方法如下：
[0032] 1、篩選方法
[0033]取10g樣品在無菌條件下充分研磨，加入裝有90mL無菌水(帶玻璃珠）的三角瓶中， 振蕩20min。取5mL樣品懸液接入裝有l(wèi)OOmL液體L