越南槐內生細菌b29在防治三七根腐病中的應用
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術領域,特別涉及一種越南槐內生細菌B29在防治三七根腐病 中的應用。
【背景技術】
[0002] 現(xiàn)代農業(yè)對植物病害的防治過度依賴于化學農藥的使用,大量化學農藥的施放不 僅對生態(tài)環(huán)境具有長期的破壞作用,也引起農產品品質下降,農藥殘留超標、病原菌的耐藥 性以及對人畜有害等諸多問題。尋找更為安全、有效的病害防治方法具有重大的意義,利用 生物的方法來防治植物病害可以有效解決上述問題。
[0003] 三七(PanaxnotoginsengF.H.chen)又名田七、金不換等,具有顯著的活血化瘀、 消腫定痛功效,是一種中國傳統(tǒng)名貴藥材。以三七為主要原料制成的中成藥如"云南白藥" 和"片仔癀"等廣為流傳。近年來,對三七原材料的需求日益增長。但是栽培過程中的真菌病 害嚴重影響了三七生長。目前,在三七種植上,防治真菌病害過度依賴化學農藥,大量化學 農藥的使用不僅影響了三七的品質,也造成了三七藥材的大量農藥殘留。
[0004] 三七根腐病為三七主要病害之一,在產區(qū)俗稱"綠臭",主要癥狀為苗期的芽腐及 其蘆頭和芽基結合處的褐色水漬狀病變直至蔓延至整個莖桿基部。該病出苗期就有發(fā)生, 4、5月病害停滯,6-9月進入多雨季節(jié),進入發(fā)病高峰期。根腐病有多種類型,據(jù)報道其癥狀 大都由三七根腐病菌(Fusariumsolani)(簡稱F.solani)引起。
[0005]這個真菌病害是造成多年來三七產品質量和產量下降的主要原因之一。在廣西三 七的傳統(tǒng)道地產區(qū),由于低海拔及高溫多濕的氣象條件,這種病害往往是同時發(fā)生的,造成 了三七的大量減產甚至絕收,給種植戶帶來了巨大的經濟損失。為了控制這個真菌病害,大 量的化學農藥被使用,造成了三七產品的大量農藥殘留,嚴重的污染了環(huán)境,大大的威脅了 人們的健康。因此,開展生物防治三七真菌病害對三七產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展是非常迫切和必 要的。為此篩選出能同時拮抗這種病害的拮抗菌具有重大意義,篩選進而開發(fā)利用拮抗菌 也是有效控制三七真菌病害最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐未胧┲弧?br>[0006]公開于該【背景技術】部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解,而不應 當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現(xiàn)有技術。
【發(fā)明內容】
[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種越南槐內生細菌B29在防治三七根腐病中的應用,從 而能有效的防治三七種植過程中出現(xiàn)的三七根腐病,從而提高三七的產量以及質量。
[0008]為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供的技術方案如下:
[0009] -種越南槐內生細菌B29,越南槐內生菌B29的分類命名為伯克霍爾德氏菌 (Burkholderiasp.)B29,菌株的16SrDNA基因序列表如SEQIDN0.1所述,保藏單位:中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號 中國科學院微生物研究所,保藏日期:2015年05月13日,保藏號:CGMCCNo. 10807。
[0010]優(yōu)選的是,所述越南槐內生細菌B29代謝產物的制備方法為:將越南槐內生細菌B29接種于NB液體培養(yǎng)基中,置于溫度為28°C、轉速為130r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)10天,所得 發(fā)酵物超聲40min,然后用乙酸乙酯萃取2次,取乙酸乙酯相進行減壓濃縮得到菌株發(fā)酵物 的乙酸乙酯粗提物,即為越南槐內生細菌B29代謝產物。
[0011]優(yōu)選的是,所述越南槐內生細菌B29接種于含1000mlNB液體培養(yǎng)基。
[00?2]優(yōu)選的是,所述的NB液體培養(yǎng)基含牛肉浸膏3g,酵母膏l(xiāng)g,蛋白胨5g,鹿糖10g,培 養(yǎng)基pH值為7.0。
[0013]如上述制備所得越南槐內生細菌B29的代謝產物在防治三七根腐病中的應用。
[0014]與現(xiàn)有技術相比,本發(fā)明具有如下有益效果:
[0015]本發(fā)明首次從藥用植物越南槐的根中分離篩選到一株內生細菌(Burkholderia sp.)B29,該菌對三七根腐病菌具有很強的抑制作用,為三七真菌病害的生物防治領域帶來 廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0016]圖1是本發(fā)明越南槐內生細菌B29與三七根腐病的平板對峙培養(yǎng),其中F為三七根 腐病菌(Fusariumsolani),a為空白對照,b為實驗組。
[0017]圖2是本發(fā)明越南槐內生細菌B29菌株形態(tài)特征,其中,al為菌落形態(tài),b1為菌體形 ??τ〇
[0018]圖3為越南槐內生細菌Β29菌株基于16SrDNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0019]圖4是根據(jù)本發(fā)明菌株越南槐內生細菌B29的代謝產物對三七根腐病菌的菌絲生 長的抑制效果;其中第1、第5個為空白對照即不含藥的PDA平板;第2、第3、第4個為陽性對照 多菌靈粉劑;第6、第7、第8為菌株B29的代謝產物,且濃度分別為2mg/ml,4mg/ml,8mg/ml;F 為三七根腐病菌Fusariumsolani〇
【具體實施方式】
[0020] 下面結合【具體實施方式】進行詳細描述,但應當理解本發(fā)明的保護范圍并不受具體 實施方式的限制。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實施 例中所使用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。乙酸乙酯為市購分析純 乙酸乙酯。2XTagMasterMix購自寶生物工程有限公司(Takara),Primer_l、Primer_2由華 大基因合成。
[0021] 實施例1
[0022]菌株的分離、篩選及鑒定 [0023] 一、菌株的分離
[0024]供試材料:采自廣西天等縣石灰?guī)r地區(qū)的野生越南槐。
[0025]供試菌株:由廣西大學植物病理研究所提供。
[0026]培養(yǎng)基:1000mlNA培養(yǎng)基:牛肉浸膏3g,酵母膏l(xiāng)g,蛋白胨5g,鹿糖10g,瓊脂15g,pH7.0〇
[0027] 表面消毒:將長為6-8cm、寬為l-2cm新鮮健康的越南槐根用流水沖洗30min以沖干 凈泥沙,然后將洗凈的越南槐根用無菌水漂洗2次,風干表面水分,移到超凈工作臺,在無菌 條件下,將越南槐根用體積濃度為75%乙醇浸泡lmin,無菌水漂洗2次,次氯酸鈉(有效氯 1 % )浸泡2min,無菌水洗3次,無菌吸水紙吸干表面?zhèn)溆谩?br>[0028]菌株的分離、純化:表面消毒好的越南槐根,無菌條件下,用無菌木片刮去表皮,用 無菌枝剪剪去越南槐根的兩端,余下部分用無菌小刀和無菌鑷子分開木質部和韌皮部,分 別取0.5cm長的組織塊,用無菌枝剪剪碎并加無菌水研磨,研磨充分后加無菌水定容至5ml 并靜置lOmin,取0.5ml上清液梯度稀釋10~105倍,分別取100yL稀釋液涂布到ΝΑ平板上,每 個稀釋濃度重復3次,取最后一次漂洗液涂布在ΝΑ平板上,作為陰性對照。ΝΑ平板置于培養(yǎng) 箱28°C恒溫培養(yǎng)24~96h,挑取不同形態(tài)菌落反復劃線純化,將純化的菌株即越南槐內生細 菌用20 %甘油保存。
[0029]將分離到的越南槐內生細菌接種于LA平板上,28°C下培養(yǎng)24h后待用。將三七根腐 病菌接種于PDA平板,28°C下培養(yǎng)3天后待用。
[0030]二、篩選
[0031]采用平板對峙法對供試越南槐內生細菌進行菌體抑菌活性的初篩。
[0032]首先,無菌條件下,用滅菌打孔器將三七根腐病菌制成6mm菌餅;在處理組中,將三 七根腐病菌菌餅轉接到含NA的培養(yǎng)皿中央,然后在距離菌餅2cm的位置,將分離到的越南槐 內生細菌菌株接上一條細菌線,每株內生細菌重復3皿;在對照組中,只接三七根腐病菌菌 餅,不接越南槐內生細菌,重復3皿。然后,在28°C下培養(yǎng),定期觀測。待對照組中真菌長滿培 養(yǎng)皿時,在處理組中,測量三七根腐病菌菌餅中心到越南槐內生細菌線中心之間三七根腐 病菌的生長半徑為處理生長半徑;在對照組中,三七根腐病菌的生長半徑為對照生長半徑。 最后,根據(jù)以下公式,計算抑菌率:
[0033]對照生長量=對照生長半徑-菌餅半徑 [0034]處理生長量=處理生長半徑-菌餅半徑
[0036]結果共得到3株對三七根腐病菌抑制作用都很強的拮抗越南槐內生細菌菌株,其 中一株名稱為B29,對三七根腐病菌的抑制率為71 %。
[0037]三、鑒定
[0038](一)菌株形態(tài)特征
[0039]菌落形態(tài)特征觀察:將待鑒定的菌株接種在NA培養(yǎng)基上,置于28°C培養(yǎng)24h,觀察 菌株的菌落形態(tài)特征。
[0040]菌體形態(tài)特征觀察:取上述在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h的菌株進行革蘭氏染色并鏡檢, 將所觀察到的形態(tài)結果顯微照相,如圖2所示。
[0041](二)菌株16S rDNA序列及其系統(tǒng)發(fā)育學分析
[0042] DNA模板的制備:
[0043]試劑:(1)裂解緩沖液:Tris-Ac(pH7.8)40mM,NaAc20mM,EDTAlmM,SDSl%(w/ v);
[0044] (2)5MNaCl溶液。
[0045] DNA提?。?br>[0046] (a)將1.5ml細菌過夜培養(yǎng)液培養(yǎng)物置于微量離心管(EP管)內,12000rpm離心 0.5min,棄去上清液,保留沉淀物;
[0047] (b)在沉淀物中加入400μ1裂解緩沖液,用吸管反復吹打使之重懸;
[0048] (c)加入200ul5ΜNaCl,充分混勻,12000rpm離心lOmin,取600μ1 上清液;
[0049] (d)加入等體積的酚/氯仿(1:1),混勻,離心(12000rpm,10min),將上清液轉入另 一干凈的EP管中;
[0050] (e)向步驟(d)中獲得的上清液中加入等體積氯仿,混勻,離心(12000rpm,lOmin), 將上清液轉入另一干凈的EP管中;
[0051] (f)向步驟(e)中所得上清液中加入等體積的異丙醇,混勻,置于室溫lOmin,離心 (12000rpm,15min),棄去上清液,保留沉淀物;
[0052] (g)用體積濃度為70%乙醇洗滌步驟(f)所得沉淀物,晾干,即為DNA;
[0053] (h)將步驟(g)中已干的DNA溶于30μ1雙蒸水(ddH20)中,-20°C保存。
[0054]PCR擴增16S rDNA序列:
[0055](l)PCR儀