可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿 菌及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在生物學(xué)領(lǐng)域，為了便于跟蹤研究，熒光標(biāo)記方式是最常用的一種。傳統(tǒng)的熒光分 子在發(fā)光的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生具有毒性的氧自由基，導(dǎo)致被觀察的細(xì)胞死亡，這叫做"光毒性"， 因此大多只能通過熒光標(biāo)記來研究死亡細(xì)胞靜態(tài)結(jié)構(gòu)，而無直接跟蹤進(jìn)行活體動(dòng)態(tài)的研 究。
[0003] 相比傳統(tǒng)的突光標(biāo)記，綠色突光蛋白（greenfluorescentprotein)在一種學(xué)名 Aequoreavictoria的水母中發(fā)現(xiàn)，其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長范圍的光線激發(fā) 下，會(huì)發(fā)出綠色螢光，且"光毒性"非常弱；所以此后在生物分子學(xué)領(lǐng)域綠色熒光蛋白基因常 被用作為一個(gè)報(bào)導(dǎo)基因使用；現(xiàn)在可供選擇利用的綠色熒光蛋白的突變體或衍生物有增強(qiáng) 型綠色熒光蛋白（EGFP)，藍(lán)色熒光蛋白（EBFP)和黃色熒光蛋白（YFP)等等。
[0004] 但是包含綠色熒光蛋白基因的重組受體，一般較難與原始狀態(tài)下活體組織的原始 細(xì)胞競爭。比如，利用載體重組技術(shù)標(biāo)記模式大腸桿菌，如DH5a和TG-1等非常簡單，但該 模式大腸桿菌是經(jīng)過人工改造過的，第一無法定植到動(dòng)物腸道內(nèi)，第二因?yàn)樾枰M(jìn)行重組 表達(dá)而使代謝能力降低，所以無法和正常腸道菌群競爭。因此，現(xiàn)有通過綠色熒光蛋白基因 的重組的大腸桿菌，無法良好地實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)跟蹤檢測動(dòng)物腸道菌在逆境環(huán)境下（如不同藥物 處理）的變化或變異情況，也不利于掌握動(dòng)物腸道菌在逆境下的變異規(guī)律。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明實(shí)施例的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種可以與正常定植的 并與動(dòng)物腸道其它菌群具有較強(qiáng)競爭性，并能適于逆境環(huán)境下便于實(shí)時(shí)跟蹤檢測的熒光標(biāo) 記大腸桿菌。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：
[0007] -種可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌制備方法，包括如下步驟：
[0008] PCR擴(kuò)增EGFP基因；
[0009] 將所述PCR擴(kuò)增獲得的EGFP基因與環(huán)狀質(zhì)粒載體重組，得到重組質(zhì)粒；所述環(huán)狀 質(zhì)粒載體為pCR2.lc-TOPO或pTrcHisB;
[0010] 獲取待定植動(dòng)物腸道的大腸桿菌，并進(jìn)行感受態(tài)處理后形成感受態(tài)腸道大腸桿 菌；
[0011] 將重組質(zhì)粒導(dǎo)入至感受態(tài)腸道大腸桿菌，形成轉(zhuǎn)化工程菌，即為本發(fā)明可定植動(dòng) 物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌。
[0012] 本發(fā)明進(jìn)一步還提出一種根據(jù)上述方法制備的可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸 桿菌。
[0013] 本發(fā)明的上述方法步驟綜合利用綠色熒光蛋白基因和原始腸道大腸桿菌的優(yōu)勢， 構(gòu)建出可穩(wěn)定在動(dòng)物腸道菌中表達(dá)的重組質(zhì)粒PCR2. 1c-TOPO-EGFP(弱控制型）或pTrcHis B-EGFP(可調(diào)控的強(qiáng)控制型），標(biāo)記的動(dòng)物腸道大腸桿菌可用于示蹤研究，實(shí)時(shí)跟蹤檢測動(dòng) 物腸道菌在逆境環(huán)境下（如不同藥物處理）的變化或變異情況，或用于研究微生物在食物 和環(huán)境中的生長變化、以及可用于許多其他相關(guān)研究。相比現(xiàn)有標(biāo)記工程菌，取料于原始腸 道大腸桿菌，并且具有卡那霉素或氨芐青霉素等抗性，逆境環(huán)境下可以具有更優(yōu)的競爭性， 并且其表達(dá)還可以通過跟蹤需求進(jìn)行控制。
【附圖說明】
[0014] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：
[0015] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例可見光和紫外燈下觀察質(zhì)粒pCR2.lc-TOPO-EGFP在DH5α中 的表達(dá)結(jié)果圖；
[0016]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1和實(shí)施例2所獲得的可定植動(dòng)物腸道大腸桿菌體外培養(yǎng)實(shí) 驗(yàn)結(jié)果；
[0017] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例大鼠腸道大腸桿菌及具有EGFP標(biāo)記的可定植大鼠腸道的熒 光標(biāo)記大腸桿菌的體外生長曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0019] 本發(fā)明實(shí)施例提供一種可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌制備方法，包括如下 步驟：
[0020] S10,以pEGFP-C3基因?yàn)槟０?，利用特異性設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增EGFP基因；
[0021]S20,將擴(kuò)增后的EGFP基因酶切后，與環(huán)狀質(zhì)粒pCR2.lc-TOPO或者pTrcHisΒ 相連接，得到可在模式大腸桿菌以及動(dòng)物腸道分離菌中穩(wěn)定表達(dá)EGFP的原核表達(dá)載體 pCR2.lc-TOPO-EGFP或者pTrcHisB-EGFP;
[0022] S30,獲取待定植動(dòng)物腸道的大腸桿菌，并進(jìn)行感受態(tài)處理后形成感受態(tài)腸道大腸 桿菌；
[0023]S40,將原核表達(dá)載體pCR2.lc-TOPO-EGFP或者pTrcHisB-EGFP導(dǎo)入至感受態(tài)腸 道大腸桿菌，形成轉(zhuǎn)化工程菌，即為本發(fā)明可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌。
[0024] 其中，在上述步驟S10中，pEGFP-C3為本發(fā)明中采用的EGFP基因擴(kuò)增模板，是較 為通用的EGFP基因模板，比較容易獲得。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員在實(shí)施中也可以根據(jù)獲得 的便利性選擇其他更容易或者擴(kuò)增效果更好的模板進(jìn)行PCR。并且在該步驟中特異性設(shè)計(jì) 引物包括兩對(duì)引物，分別為T0P0-P1和T0P0-P2、以及TrcB-Pl和TrcB-P2 :
[0025]
[0026] 其中，在上述引物中分別引入sacl和BamHI酶切位點(diǎn)，那么在擴(kuò)增之后目的基因 條帶首尾兩端分別具有sacl和BamHI酶切位點(diǎn)，因此獲得與pCR2.lc-TOPO或pTrcHisB 連接并轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5ct后，可以進(jìn)行雙酶切以便于測序和驗(yàn)證的融合質(zhì)粒。而且，在 本發(fā)明中采用pCR2.lc-TOPO和pTrcHisB作為質(zhì)粒，其目的還在于因?yàn)楸旧韕CR2.lc-TOPO 質(zhì)粒自帶卡那霉素（Kan)基因，pTrcHisB質(zhì)粒自帶的氨節(jié)青霉素（Amp)基因；其一可以便 于篩選提升目標(biāo)菌株篩選的準(zhǔn)確率；其二在轉(zhuǎn)化后形成的標(biāo)記后的大腸桿菌定植于動(dòng)物腸 道后，在逆境環(huán)境下（比如不同藥物處理環(huán)境下）由于其本具有良好的抗性使其更具優(yōu)良 的存活性，相比腸道大腸桿菌能夠具備競爭性，利于長久監(jiān)測掌握動(dòng)物腸道菌在逆境下的 變異規(guī)律。并且更進(jìn)一步地，環(huán)狀質(zhì)粒載體PCR2.lc-TOPO和pTrcHis-B中，其中前者含有 lac啟動(dòng)子，而后者含有強(qiáng)啟動(dòng)子trc以及l(fā)ac抑制子laclq，并且其表達(dá)還可以通過跟蹤 需求進(jìn)行控制和選擇，實(shí)現(xiàn)綠色熒光標(biāo)記的目的。
[0027] 進(jìn)一步在上述步驟S30獲取待定植動(dòng)物腸道的大腸桿菌中，可以選用從待定植動(dòng) 物糞便樣品中獲得，具體可以將樣品進(jìn)行稀釋后培養(yǎng)基純化培養(yǎng)。當(dāng)然在純化培養(yǎng)后需要 進(jìn)一步驗(yàn)證是否為大腸桿菌，驗(yàn)證的方式可以采用API20E試劑盒進(jìn)行確證。當(dāng)驗(yàn)證純化培 養(yǎng)的菌株為目的大腸桿菌后，再根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)對(duì)分離的菌株進(jìn)行抗生素敏感性測試，然后 分別挑選20株豬源和鼠源的敏感大腸桿菌，用于制備感受態(tài)細(xì)胞。
[0028] 在本發(fā)明上述步驟S20之后、S30之前，由于在實(shí)施中需要對(duì)連接成功的質(zhì)粒進(jìn)行 篩選純化和驗(yàn)證，以保證后續(xù)步驟進(jìn)行的正確性；因此在步驟S20之后還包括如下處理步 驟：
[0029] S21，采用感受態(tài)的大腸桿菌DH5a作為受體載體，將步驟S20連接處理后的 pCR2. lc-TOPO或pTrcHis-B質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH5 a中進(jìn)行培養(yǎng)
[0030] S22,將培養(yǎng)轉(zhuǎn)化處理后的大腸桿菌DH5a菌液重懸液涂布LB板上；其中在這一步 驟中為了初步篩選導(dǎo)入有連接成功的質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a，LB平板中含有50μg/mL卡那 霉素或100μg/mL氨芐青霉素；
[0031] S23,挑選步驟S22進(jìn)行LB平板培養(yǎng)后的單一菌落，接種到含有50μg/mL卡那霉 素或100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37°C進(jìn)行大量培養(yǎng)。
[0032] S24,從步驟S23步驟中所獲得的大量培養(yǎng)的菌體中抽提重組質(zhì)粒，并通過雙酶切 (