一種高效富集血小板的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效富集血小板的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血小板是一種具有較小體積的無(wú)核細(xì)胞，小于紅細(xì)胞和白細(xì)胞，只存在于哺乳動(dòng) 物血液中，在正常血液中有較恒定的數(shù)量(如人體全血中血小板濃度為1~3 X105/ml)，其 除了可以在止血的時(shí)候提供凝聚作用外，還能通過(guò)胞內(nèi)α顆粒的脫顆粒作用釋放大量細(xì)胞 生長(zhǎng)因子，包括血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-iKTGF-β)、類胰島素生長(zhǎng)因子-l(IGF-l)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等，可誘導(dǎo)骨細(xì)胞的分裂 增殖及膠原合成，促進(jìn)骨組織的修復(fù)與重建。血小板可從患者自身全血中提取，經(jīng)富集處理 后發(fā)揮治療作用，具有來(lái)源豐富，取材方便，分離簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于骨科、口腔科、運(yùn) 動(dòng)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。
[0003] 現(xiàn)有的血小板人工富集方法主要采用富血小板血漿(PRP)法，得到PRP用于實(shí)驗(yàn)研 究和臨床治療。PRP是全血經(jīng)過(guò)離心分離得到的血小板濃縮物，其制備原理是利用血液中各 種成分沉降速度不同，通過(guò)離心將血液分層。全血經(jīng)低速離心可分為三層，上層是貧血小板 血漿層(PPP)、中間為富血小板血漿層(PRP)、下層為紅細(xì)胞層，取中間層可得到高度濃縮的 含血小板血漿。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)例如富血小板血漿(PRP)法主要都是采用從人血里面直接提取血小板， 但這樣收集得到的血小板的數(shù)量有限，并且直接回輸血小板后，血小板的增加值低于預(yù)期 的回升值，即出現(xiàn)血小板輸注無(wú)效的現(xiàn)象；同時(shí)，直接向人體輸注血小板也不可避免地增加 了血源性感染及輸血反應(yīng)發(fā)生的概率，并且我國(guó)各大城市的血小板供應(yīng)存在極大的缺口， 因此，臨床上急需一種新的替代治療法來(lái)有效的治療血小板減少癥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供一種能較快恢復(fù)患者血小板數(shù)目及功能 的高效富集血小板的方法，其不僅臨床安全性高，而且可以減少同種免疫抗體的產(chǎn)生，降低 輸血量及血源性感染的危險(xiǎn)。
[0006]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)該目的：
[0007] -種高效富集血小板的方法，將臍血中的巨核細(xì)胞分離并進(jìn)行培養(yǎng)，然后輸注入 人體內(nèi)產(chǎn)生大量血小板，每個(gè)巨核細(xì)胞平均能夠產(chǎn)生2000個(gè)血小板。
[0008]其中，巨核細(xì)胞分離培養(yǎng)包括巨核細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)以及巨核細(xì)胞懸液的制備步 驟。
[0009]作為優(yōu)選的，所述巨核細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)包括以下步驟：
[0010] 1)用抗凝采血管采集臍血，將l〇〇ml臍血與濃度為0.06g/ml羥乙基淀粉混合，臍血 與羥乙基淀粉的體積比為3~6:1，充分混勻后靜止30min以上，沉降紅細(xì)胞，吸取上清液，并 加至裝有等體積的淋巴細(xì)胞分離液的離心分離管中，2000rpm離心20min，收集單個(gè)核細(xì)胞；
[0011 ] 2)將收集到的單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗滌，1500rpm離心lOmin，重復(fù)2次；
[0012] 3)將洗滌后的單個(gè)核細(xì)胞按密度為1X106接種于MDM培養(yǎng)基中，并加入濃度為50 ~100ng/ml的rhG-CSF，連續(xù)培養(yǎng)7天；
[0013] 4)將上述步驟3)中的單個(gè)核細(xì)胞收集離心，1500rpm離心lOmin后，用StemSpan SFEM無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，并加入細(xì)胞生長(zhǎng)因子SCF20~100ng/mL、20~100ng/mLTP0、10~ 50ng/mLIL-3、20~100ng/mLIL-6、20~100ng/mLIL-11、10~50IU/ml肝素，置于37°C、 5 %⑶2、5 %02、90 %N2的條件下培養(yǎng)，每隔2天進(jìn)行原體積的1/3量的換液，連續(xù)培養(yǎng)4~10 天；
[0014]所述巨核細(xì)胞懸液的制備包括以下步驟：
[0015] 5)將上述培養(yǎng)11~17天的巨核細(xì)胞進(jìn)行收集，1500rpm離心5min，棄上清；
[0016] 6)將步驟5)獲得的巨核細(xì)胞用生理鹽水重懸，離心1500rpm離心5min，棄上清；
[0017] 7)最后將收集到的巨核細(xì)胞重懸于生理鹽水中，制備成巨核細(xì)胞懸液。
[0018]進(jìn)一步的，對(duì)步驟2)收集的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量為（0.85 ± 0.42)X108個(gè)，其中巨核細(xì)胞占比0.5 %左右，取1.0X108個(gè)單核球細(xì)胞，含巨核祖細(xì)胞約 (2·82±0·35)X105個(gè)。
[0019] 進(jìn)一步的，所述步驟3)中經(jīng)過(guò)rhG-CSF刺激培養(yǎng)后，CD34+細(xì)胞的含量明顯提高10 倍左右，達(dá)到（2.62±0.57)X106個(gè)。
[0020] 進(jìn)一步的，所述步驟4)中連續(xù)培養(yǎng)4~10天后，⑶34+細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增了35.21 ± 1.24 倍，其中巨核細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的70 %，S卩（9.23 ± 3.25)X107個(gè)。
[0021] 作為優(yōu)選的，所述步驟7)中將巨核細(xì)胞重懸于生理鹽水，制備成200ml的細(xì)胞懸 液，每袋細(xì)胞總量控制在0.5~1X107個(gè)。
[0022] 相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的高效富集血小板的方法，采用的 是先誘導(dǎo)擴(kuò)增臍血里的巨核細(xì)胞，待得到較成熟的巨核細(xì)胞后再回輸?shù)饺梭w內(nèi)，每個(gè)巨核 細(xì)胞在人體內(nèi)平均能產(chǎn)生2000個(gè)血小板，能夠快速恢復(fù)患者血小板數(shù)目及功能，該方法不 僅臨床安全性高，而且可以減少同種免疫抗體的產(chǎn)生，降低輸血量及血源性感染的危險(xiǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0024] 實(shí)施例1。
[0025]本實(shí)施例提供一種高效富集血小板的方法，包括巨核細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)以及巨核細(xì) 胞懸液的制備步驟。
[0026]其中，所述巨核細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)包括以下步驟：
[0027] 1)用抗凝采血管采集臍血，將100ml臍血與濃度為0.06g/ml羥乙基淀粉混合，臍血 與羥乙基淀粉的體積比為3:1，充分混勻后靜止30min以上，沉降紅細(xì)胞，吸取上清液，并加 至裝有等體積的淋巴細(xì)胞分離液的離心分離管中，2000rpm離心20min，收集單個(gè)核細(xì)胞； [0028] 2)將收集到的單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗滌，1500rpm離心lOmin，重復(fù)2次；
[0029] 3)將洗滌后的單個(gè)核細(xì)胞按密度為1X106接種于IMDM培養(yǎng)基中，并加入濃度為 50ng/ml的rhG-CSF，連續(xù)培養(yǎng)7天；
[0030] 4)將上述步驟3)中的單個(gè)核細(xì)胞收集離心，1500rpm離心lOmin后，用StemSpan SFEM無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，并加入細(xì)胞生長(zhǎng)因子SCF、TPO、IL-3、IL-6、IL-11和肝素，其終濃度 分別為2〇1^/1111^、2〇1^/1111^、10叫/1111^、2〇1^/1111^、20叫/1111^、1011]/1111^，置于37。〇、5%〇〇2、5%〇2、 90%N2的條件下培養(yǎng)，每隔2天進(jìn)行原體積的1/3量的換液，連續(xù)培養(yǎng)4天；
[0031 ]所述巨核細(xì)胞懸液的制備包括以下步驟：
[0032] 5)將上述培養(yǎng)11天的巨核細(xì)胞進(jìn)行收集，1500rpm離心5min，棄上清；
[0033] 6)將步驟5)獲得的巨核細(xì)胞用生理鹽水重懸，離心1500rpm離心5min，棄上清；
[0034] 7)最后將收集到的巨核細(xì)胞重懸于生理鹽水中，制備成200ml的細(xì)胞懸液，每袋細(xì) 胞總量控制在0.5~IX107個(gè)。
[0035] 實(shí)施例2。
[0036]本實(shí)施例提供一種高效富集血小板的方法，包括巨核細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)以及巨核細(xì) 胞懸液的制備步驟。
[0037]其中，所述巨核細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)包括以下步驟：
[0038] 1)用抗凝采血管采集臍血，將100ml臍血與濃度為0.06g/ml羥乙基淀粉混合，臍血 與羥乙基淀粉的體積比為6:1，充分混勻后靜止30min以上，沉降紅細(xì)胞，吸取上清液，并加 至裝有等體積的淋巴細(xì)胞分離液的離心分離管中，2000rpm離心20min，收集單個(gè)核細(xì)胞； [0039] 2)將收集到的單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗滌，1500rpm離心lOmin，重復(fù)2次；
[0040] 3)將洗滌后的單個(gè)核細(xì)胞按密度為1X106接種于IMDM培養(yǎng)基中，并加入濃度為 100ng/ml的rhG-CSF，連續(xù)培養(yǎng)7天；
[0041 ] 4)將上述步驟3)中的單個(gè)核細(xì)胞收集離心，1500rpm離心lOm