一種谷氨酸脫羧酶突變體及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種谷氨酸脫羧酶突變體及其制備方 法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷氨酸脫駿酶(glutamatedecarboxylase，簡(jiǎn)稱GAD;E(^4.1 · 1 · 15)以磷酸吡咳酸 (PLP)為輔酶，能專一1性地催化L-谷氨酸脫羧合成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyrate，GABA) 的酶。GABA廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，在哺乳 動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有抑制過(guò)度興奮、解除神經(jīng)緊張等生理功能。此外，GABA具有預(yù)防血 管硬化、延緩衰老、修復(fù)皮膚、降血壓、鎮(zhèn)靜安神、改善睡眠和記憶力等多種重要的生理功 能，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、功能食品和動(dòng)物飼料等行業(yè)。2009年，我國(guó)衛(wèi)生部正式批準(zhǔn) GABA為"新資源食品"。
[0003]在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，良好的熱穩(wěn)定性是理想的生物催化劑所應(yīng)具備的特征之一。 工業(yè)生物催化過(guò)程中酶不僅處于不斷"消耗"的過(guò)程，而且操作過(guò)程中會(huì)有針對(duì)性地采用更 高的溫度，以提高反應(yīng)速率，增加底物溶解度，降低體系粘度等，因此對(duì)酶的熱穩(wěn)定性提出 了更高的要求。細(xì)菌中GAD酶在50°C以上極易失活，這嚴(yán)重制約GAD在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0004] 本課題組前期篩選到一種生產(chǎn)γ-氨基丁酸的短乳桿菌(Lactobacillusbrevis) CGMCCNO. 1306，對(duì)該菌株的GAD基因進(jìn)行克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a( + )-GAD1407，轉(zhuǎn)化到 大腸桿菌BL21(DE3)中，實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)（申請(qǐng)?zhí)?01010567447.9的專利文獻(xiàn)）。但是，實(shí) 驗(yàn)表明谷氨酸脫羧酶在55°C下的半衰期僅為30.9min，非常不利于GAD在GABA生物制備中的 應(yīng)用，其耐熱性穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提尚。
[0005] 定點(diǎn)突變(site-directedmutagenesis)是指通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法 向目的DNA片段(基因組或質(zhì)粒）中引入特定堿基對(duì)的技術(shù)(包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變 等），通過(guò)改變基因特定位點(diǎn)核苷酸序列來(lái)改變所編碼的氨基酸序列，可迅速、高效的提高 DNA所表達(dá)目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。
[0006]大量研究表明，蛋白質(zhì)分子中引入脯氨酸(Prolinetheory)可以降低蛋白質(zhì)去折 疊的骨架熵，增加蛋白質(zhì)的剛性，顯著提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。但是蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性受諸 多因素的影響，因此并非所有的脯氨酸替換都能提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，只有在合適的位 點(diǎn)進(jìn)行脯氨酸替換才能真正改善其熱穩(wěn)定性。
[0007] 公告號(hào)為CN103031322B的專利文獻(xiàn)公開了一種谷氨酸脫羧酶熱穩(wěn)定變體G311P 基因，其核苷酸序列在第311位有定點(diǎn)突變。公告號(hào)為CN103031323B的專利文獻(xiàn)公開了一 種谷氨酸脫羧酶熱穩(wěn)定變體G56P基因，其核苷酸序列在第56位有定點(diǎn)突變。研究發(fā)現(xiàn)，此位 點(diǎn)突變后得到的變體基因編碼的谷氨酸脫羧酶的熱穩(wěn)定性有所增強(qiáng)。通過(guò)在編碼野生GAD 酶基因基礎(chǔ)上進(jìn)行定點(diǎn)突變，提高了其對(duì)應(yīng)變體酶在在60°C和70°C下的熱穩(wěn)定性。隨著酶 熱穩(wěn)定性的提高，在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中可以采用更高的操作溫度，以提高反應(yīng)速率、增加底物 溶解度，有利于利用該酶通過(guò)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA。
[0008] Haruyuki Atomi等（Journal of Bacteriology，2014,196)報(bào)道嗜熱古細(xì)菌 Thermococcus kodakarensis GAD的最適反應(yīng)溫度達(dá)到80°C，該酶在80°C和90°C的半衰期 分別為l〇h和5.5h。應(yīng)用同源比對(duì)策略，對(duì)熱穩(wěn)定性差的野生型蛋白質(zhì)進(jìn)行改造將是提高蛋 白質(zhì)熱穩(wěn)定性的有效手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明根據(jù)與嗜熱古細(xì)菌(Thermococcus kodakarensis)GAD氨基酸序列的比對(duì) 信息，采用定點(diǎn)突變的方法在短乳桿菌GAD對(duì)應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)引入脯氨酸殘基，通過(guò)理性設(shè) 計(jì)提高GAD的熱穩(wěn)定性，獲得的突變體比野生型GAD具有更好的熱穩(wěn)定性，提高了GAD在工業(yè) 上的應(yīng)用價(jià)值。
[0010] 一種谷氨酸脫羧酶突變體，氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。
[0011] 本發(fā)明研究的基礎(chǔ)是來(lái)自短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)CGMCCNO.1306的 GAD1407基因。本發(fā)明提供的谷氨酸脫羧酶突變體氨基酸序列的第364位由甘氨酸G突變?yōu)?脯氨酸P，該突變體(G364P)的半失活溫度(T5Q15)為61.6°C，比野生型酶提高2.5°C;在55°C 下的半衰期(ti/2)為45.4min，比野生型酶延長(zhǎng)14.5min。
[0012] 本發(fā)明提供了編碼所述谷氨酸脫羧酶突變體的基因。本發(fā)明將編碼野生型谷氨酸 脫羧酶第364位甘氨酸的密碼子GGG替換為編碼脯氨酸的CCG，該突變體的核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示。本發(fā)明還提供了包含所述基因的表達(dá)單元、重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化子。
[0013] 作為優(yōu)選，所述表達(dá)單元的啟動(dòng)子為T7啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子或araBAD啟動(dòng)子。在這 些啟動(dòng)子的作用下，谷氨酸脫羧酶的突變酶可以直接在大腸桿菌宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)可溶 表達(dá)。
[0014]作為優(yōu)選，所述重組質(zhì)粒的原始載體為質(zhì)粒pET28a( + )。
[0015]作為優(yōu)選，所述轉(zhuǎn)化子的宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
[0016]本發(fā)明還提供了一種谷氨酸脫羧酶突變體的制備方法，包括以下步驟：
[0017] (1)將來(lái)自嗜熱古細(xì)菌(Thermococcuskodakarensis)的谷氨酸脫羧酶的氨基酸 序列與野生型谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，選擇來(lái)自嗜熱古細(xì)菌(Thermococcus kodakarensis)的谷氨酸脫羧酶中脯氨酸所對(duì)應(yīng)的野生型谷氨酸脫羧酶氨基酸位點(diǎn)為突變 位點(diǎn)；
[0018] (2)針對(duì)所述突變位點(diǎn)替換為脯氨酸設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物，以野生型谷氨酸脫羧酶 基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，表達(dá)獲得定點(diǎn)突變體；
[0019 ] (3)從所有突變體中篩選獲得熱穩(wěn)定性最高的酶突變體。
[0020]該方法可有效增加突變成功的概率，降低篩選工作量，提高實(shí)驗(yàn)效率。采用該方法 獲得的突變體比野生型GAD具有更好的熱穩(wěn)定性，從而證明了本發(fā)明通過(guò)同源比對(duì)策略選 擇突變位點(diǎn)的篩選方案是可行的。
[0021 ]作為優(yōu)選，所述野生型谷氨酸脫羧酶分離自短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)。 [0022] 本發(fā)明對(duì)短乳桿菌GAD氨基酸序列與嗜熱古細(xì)菌(Thermococcuskodakarensis) GAD氨基酸序列對(duì)比，引入脯氨酸的突變位點(diǎn)分別為M70、K89、S162、A224、A242、A261、G277、 ￥284、￥306、￥323、6364、6372^427，采用?〇?定點(diǎn)突變的方法對(duì)上述位點(diǎn)進(jìn)行突變，獲得突 變酶。通過(guò)測(cè)定半失活溫度(T5Q15)和半衰期(t1/2)對(duì)突變酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行表征，最終獲得 一種GAD熱穩(wěn)定性提高的突變體(G364P)。
[0023]作為優(yōu)選，制備核苷酸序列如SEQIDNO. 1的GAD突變體的定點(diǎn)突變引物為：
[0024] G364P-F:5 '-ATCGCTCACTAAATTACCGGGCTTTTCCCTCATTAAT-3 '；
[0025] G364P-R:5 '-TAATGAGGGAAAAGCCCGGTAATTTAGTGAGCGATTTC-3 '。
[0026]本發(fā)明還提供了所述谷氨酸脫羧酶突變體在催化L-谷氨酸或其鈉鹽生成γ-氨基 丁酸中的應(yīng)用。
[0027] 本發(fā)明具備的有益效果:本發(fā)明與嗜熱古細(xì)菌(Thermococcuskodakarensis)GAD 氨基酸序列比對(duì)，采用定點(diǎn)突變的方法在在短乳桿菌GAD對(duì)應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)引入脯氨酸殘 基，該方法有效提高正突變概率，節(jié)省時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率及可行性，并篩選得到熱穩(wěn)定性 優(yōu)于野生酶的突變酶，該方法能為其它酶的熱穩(wěn)定性改造提供借鑒和應(yīng)用。該突變酶在催 化L-谷氨酸或其鈉鹽生成γ-氨基丁酸的過(guò)程中具有更好的熱穩(wěn)定性，有利于GABA的工業(yè) 化生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖 1 為野生酶GAD(gi| 2953880)與嗜熱古細(xì)菌ThermococcuskodakarensisGAD (giI5716007)的氨基酸序列比對(duì)圖。
[0029] 圖2為質(zhì)粒pET28a( + )_gad的基因圖譜。
[0030]圖3為定點(diǎn)突變?cè)硎疽鈭D。
[0031]圖4為GAD突變體G364P的SDS-PAGE圖，其中l(wèi):Proteinmarker;2:40mM咪唑洗脫的 樣品；3:100mM咪唑洗脫樣品;4:250mM咪唑洗脫樣品。
[0032]圖5為突變酶G364P和野生酶GAD在pH4.8條件下的半失活溫度(T5Q15)，其中A為野 生酶GAD，B為突變酶G364P。
[0033] 圖6為突變酶G364P和野生酶的半衰期t1/2,其中A為野生酶GAD，B為突變酶G364P。
【具體實(shí)施方式】
[0034]為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，結(jié)合以下實(shí)例進(jìn)行具體說(shuō)明。
[0035] 本發(fā)明研究的基礎(chǔ)是來(lái)自短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)CGMCCN0.1306中的GAD基因。其中短乳桿菌（Lactobacillusbrevis)CGMCCNO.1306已在中國(guó)專利申請(qǐng) 200510049189.4和中國(guó)專利申請(qǐng)200510049187.5中公開，由浙江大學(xué)保藏在中國(guó)普通微生 物保藏管理中心（地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院）。本申請(qǐng)使用的菌株由浙江大學(xué)饋 贈(zèng)。
[0036] 表達(dá)宿主菌E.coliBL21(DE3)為浙江大學(xué)生物工程研究所保藏；pET28a( + )_GAD1407重組質(zhì)粒由浙江大學(xué)生物保存；FastDigestDpnI限制酶購(gòu)自Fermentas InternationalInc.Canada;PrimeStarMaxDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；Ni-NTAagarose 層析介質(zhì)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA Marker、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。培養(yǎng)基 為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，表達(dá)培養(yǎng)基為TB(胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、甘油4mL/L、KH2P〇4 17mmo1 /L、 K2HP〇4 72mmol/L)培養(yǎng)基，均含有50yg/mL卡那霉素。
[0037] 本發(fā)明根據(jù)與古細(xì)菌(Thermococcusk