一種dna亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及純化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于核酸甲基化轉(zhuǎn)化及純化領(lǐng)域，涉及一種DNA在恒溫條件、變性劑及DNA 保護試劑下，使用亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化DNA，并使用純化試劑進行轉(zhuǎn)化DNA純化，并應用于各類分子 生物學研究。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲基化是指從活性甲基化合物（如S-腺苷基甲硫氨酸）上將甲基催化轉(zhuǎn)移到其他 化合物的過程。最常見的甲基化修飾有DNA甲基化和組蛋白甲基化，本發(fā)明所涉及為DNA甲 基化。
[0003] DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化下，以S-腺苷 甲硫氨酸為甲基供體，將活性甲基轉(zhuǎn)移至DNA鏈中特定堿基上的化學修飾過程。DNA甲基化 一般發(fā)生在CpG位點（胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點，S卩DNA序列中胞嘧啶后緊連鳥嘌呤的位 點）。經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶。人類基因中約80%-90%的CpG位 點已被甲基化，但是在某些特定區(qū)域，如富含胞嘧啶和鳥嘌呤的CpG島則未被甲基化。這與 包含所有廣泛表達基因在內(nèi)的56%的哺乳動物基因中的啟動子有關(guān)。1 %-2%的人類基因 組是CpG群，并且CpG甲基化與轉(zhuǎn)錄活性成反比。DNA甲基化是一種表觀(epigenetic)修飾， 它在不改變DNA序列的情況下，對個體的生長、發(fā)育、基因表達模式以及基因組的穩(wěn)定性起 到重要的調(diào)控作用，并且這種修飾在發(fā)育和細胞增殖的過程中是可以穩(wěn)定傳遞的。近年來 的大量研究表明，DNA異常甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、細胞癌變有著密切的聯(lián)系。
[0004] 目前研究DNA甲基化的方法有很多種，但都需要經(jīng)過DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后，再運用 各種檢測手段進行相關(guān)研究。DNA在亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化過程中會使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿 嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不會被轉(zhuǎn)化。因此，可以結(jié)合NGS、MSP、HRM等方法來檢測分析DNA序 列哪些位點發(fā)生甲基化。
[0005]亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的原理非常簡單，目前的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化基本步驟分為:DNA的分離純 化，氫氧化鈉變性、亞硫酸鹽變溫轉(zhuǎn)化及脫磺酸基和脫鹽。但是亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的主要問題是 需要首先對需要轉(zhuǎn)化的核酸進行氫氧化鈉變性，而后進行長時間的轉(zhuǎn)化及變溫過程，且需 要氫氧化鈉溶液進行脫磺酸基。在此過程中，會導致DNA的嚴重降解及片段化。除了DNA降解 問題，亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA純化方法沒有較好的解決，目前商品化的試劑盒基本都是采用 離心柱方法進行產(chǎn)物純化，并且需要carrierRNA，同時需要多步洗滌過程，步驟過多而造 成DNA損耗高、提取效率降低，而且此方法需要離心機，難于實現(xiàn)自動化操作且純化效率低、 操作繁瑣、產(chǎn)率低。
[0006]因此，基于目前表觀遺傳學的快速發(fā)展，以及目前的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化方法及純化方 法的一些問題，本發(fā)明對轉(zhuǎn)化及純化方法進行了優(yōu)化改進，使DNA轉(zhuǎn)化能夠在70-90度范圍 進行轉(zhuǎn)化45-90min，并采用磁珠法對轉(zhuǎn)化DNA進行純化，能夠得到高轉(zhuǎn)化率、高質(zhì)量及高純 度的DNA，并有利于甲基化研究的全自動化及標準化操作，用于后續(xù)分子生物學研究，尤其 臨床分子診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及純化的方 法，該方法能在恒溫條件下（70-90°C)、同時在變性劑及DNA保護劑存在下進行亞硫酸鹽轉(zhuǎn) 化并對轉(zhuǎn)化DNA進行純化，并結(jié)合簡便的磁珠法純化方法，能夠快速得到高轉(zhuǎn)化率、高質(zhì)量、 高純度的DNA，本發(fā)明的方法有利于甲基化研究的全自動化及標準化操作。
[0008] 本發(fā)明涉及的DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及純化的方法，包括如下步驟：
[0009] (1)在離心管中加入20-60ul的待處理DNA;
[0010] (2)加入85-100ul轉(zhuǎn)化溶液，再加入15-35ul保護溶液，混勻；
[0011] (3)將離心管置于70-90°C恒溫金屬浴中45-90min;
[0012] (4)冷卻至室溫，向其中加入300-600ul結(jié)合液及5-20ul磁珠溶液，混勻，室溫放置 l〇-20min；
[0013] (5)將離心管置于磁力架上2-5min，待磁珠分離后，棄去上清液；
[0014] (6)加入0.5-lml洗滌液，充分混勻磁珠，然后置于磁力架上2-5min，待磁珠分離 后，棄去上清液；
[0015] (7)在磁力架上靜置l-5min，棄去上清液；
[0016] (8)再加入40-100ul洗脫液，充分混勻后，20-65°C靜置5-10min;
[0017] (9)再將離心管置于磁力架上l-2min，待磁珠分離后，轉(zhuǎn)移上清液至一新的無 DNase與RNase酶離心管中，-20度保存?zhèn)溆谩?br>[0018] 上述技術(shù)方案中，所述的轉(zhuǎn)化溶液為:含1-3MA組分和10-800mMB組分的水溶液， pH5.0-5.5，其中A組分為重亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鎂、亞硫酸氫銨中至少一種，B 組分為尿素、甲酰胺、、二甘醇二甲醚、異硫氰酸胍中的至少一種；
[0019] 所述的保護溶液為:含50-700mMC組分和10-200mMD組分的水溶液，pH5.0-6.0， 其中C組分為氫醌、三烯丙基異氰脲酸酯、水溶性維生素C、四乙烯五胺五鹽酸鹽中的至少一 種，D組分為重亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鎂、亞硫酸氫銨中的一種；
[0020] 所述的結(jié)合液為:含0.5-6ME組分、10-500mMF組分和體積濃度為10-50%G組分 的水溶液，pH5-7,其中E組分為異硫氰酸胍、鹽酸胍、高氯酸鈉、碘化鈉中至少一種，F(xiàn)組分 為Tris-HCl和HEPES中的至少一種，G組分為異丙醇、無水乙醇中至少一種；
[0021] 所述的洗滌液為:含0.5-3MΗ組分和體積濃度為10-70%1組分的水溶液，pH5-7， 其中Η組分為異硫氰酸胍、鹽酸胍、高氯酸鈉中至少一種，I組分為異丙醇和無水乙醇中至少 一種；
[0022] 所述的洗脫液為無DNase與RNase酶無菌水或tris緩沖液或ΤΕ緩沖液;所述的tris緩沖液為10mM的tris-HCl，pH7·5-8·5，所述的TE緩沖液中含10mM的tris-HCl和lmM的EDTA， pH7·5-8·5〇
[0023] 所述的磁珠溶液為含濃度為50mg/ml納米磁性顆粒的水溶液，具體為超順四氧化 三鐵或超順三氧化二鐵顆粒，且外表由表面修飾有羥基或羧基的二氧化硅包被。
[0024] 本發(fā)明涉及的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及純化的方法，其可應用于脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)化及后續(xù) 純化，所純化的轉(zhuǎn)化DNA可用于各類分子生物學檢測，尤其為臨床分子診斷。
[0025]本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)勢：
[0026] 1、本發(fā)明涉及的甲基化轉(zhuǎn)化試劑，不同于現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化方法，不需要對核酸進行前 期的氫氧化鈉變性處理，而且能在恒溫條件下高效進行變性、轉(zhuǎn)化且不降解及片段化DNA， 整個轉(zhuǎn)化時間只需要45-90min;同時可以使用恒溫金屬浴進行相關(guān)的轉(zhuǎn)化實驗，而不同于 市面上商品化試劑需要價格昂貴的PCR儀進行變溫轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時間短、儀器設(shè)備簡單，操作 更簡便。
[0027] 2、本發(fā)明涉及的磁珠法純化試劑，適用于甲基化核酸轉(zhuǎn)化后的核酸純化，利用高 鹽低pH值進行核酸的分離純化，再通過低鹽高pH值進行洗脫，具有高純度、高回收效率的特 點，并且在整個純化過程中不使用目前市場上均采用的氫氧化鈉進行去磺化步驟，操作更 簡便，更能節(jié)省整個實驗操作時間。而且整個純化過程也不需要carrierRNA，且能在常溫 下進行純化操作，無需任何高溫孵育，同時結(jié)合一種洗滌液，只進行一次洗滌過程得到高純 度的核酸，最后的洗脫也可以在常溫下進行洗脫;具有操作簡便、提高提取效率和提取純度 的優(yōu)點。
[0028] 3、本發(fā)明涉及的DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及純化的方法，將核酸上游的恒溫轉(zhuǎn)化及其下 游的磁珠分離純化有效結(jié)合起來，有利于甲基化研究的全自動化和標準化操作；
【附圖說明】
[0029]圖1為采用本發(fā)明方法與Qiagen商品化試劑盒方法來轉(zhuǎn)化及純化甲基化人基因組DNA的實時熒光PCR檢測圖；
[0030] 圖2為采用本發(fā)明方法與Qiagen商品化試劑盒方法來轉(zhuǎn)化及純化未甲基化基因組 DNA的實時熒光PCR檢測圖。
【具體實施方式】
[0031] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步說明，實施例中所涉及的百分含量均指體積濃 度。
[0032] 實施例1不同轉(zhuǎn)化溫度的對比
[0033]甲基化人基因組的獲取:采用QIAGEN商品化血液人基因組提取試劑盒提取人基因 組DNA，然后使用NEB公司的SssI甲基化轉(zhuǎn)移酶進行甲基化處理，具體操作按廠家說明書進 行，甲基化處理結(jié)束后使用天根的PCR產(chǎn)物純化試劑盒對甲基化處理的DNA進行純化，純化 后的DNA置于-20度冰箱備用。
[0034]本發(fā)明的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及純化具體實施步驟：
[0035] 1、在0.2ml離心管中加入20ul的待處理DNA(甲基化DNA或未甲基化DNA)，設(shè)置3份。 [0036] 2、每份分別加入85ul轉(zhuǎn)化溶液，再加入35ul保護溶液，混勻。
[0037] 3、將3份離心管分別置于70°C、80°C、90°C恒溫金屬浴中60min。
[0038] 4、冷卻至室溫；
[0039] 5、將轉(zhuǎn)化后的DNA分別轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，再分別加入300ul結(jié)合液、10ul磁珠 溶液，混勻，室溫放置lOmin;
[0040] 6、將離心管置于磁力架上2min，待磁珠分離后，棄去上清液；
[00411 7、加入lml洗滌液，充分混勻磁珠，然后置于磁力架上2min，待磁珠分離后，棄去上 清液；
[0042] 8、在磁力架上靜置lmin，棄去上清液；
[0043] 9、加入60ul洗脫液，充分混勾后，置于室溫5min;
[0044] 10、再將離心管置于磁力架上lmin，待磁珠分離后，轉(zhuǎn)移上清液至一新的無DNase 與RNase酶離心管中，-20度保存?zhèn)溆茫?br>[0045] 所述轉(zhuǎn)化溶液為含1.5M重亞硫酸鈉，1.5M亞硫酸氫鈉，10mM甲酰胺的水溶液， pH5.0〇
[0046] 所述的保護溶液為含50mM氫醌，100mM三烯丙基異氰脲酸酯和20mM亞硫酸氫鈉的 水溶液，PH5.0。
[0047] 所述結(jié)合液為含3.5M異硫氰酸胍，0.5M碘化鈉，100mMTris-HCl，30%異丙醇的水 溶液，PH5.0。
[0048] 所述洗滌液為含2.5Μ鹽酸胍，50 %無水乙醇的水溶液，ρΗ7.0。
[0049] 所述洗脫液為含10mMTris-HCl的水溶液，ρΗ8.5。
[0050] 三種不同溫度轉(zhuǎn)化方法得到的DNA(依次記為Α、Β、C)采用實時熒光PCR進行甲基化 檢測，檢測結(jié)果見表1。
[0051] 表 1
[0053]可以看出，在不同轉(zhuǎn)化溫度方法上，采用實時熒光PCR方法，使用MSP引物檢測甲基 化情況，各組的ct值基本相當，所以可以驗證本轉(zhuǎn)化試劑在70-90度溫度下進行轉(zhuǎn)化，且轉(zhuǎn) 化效率一致，，相對于傳統(tǒng)的變溫方法而言，本發(fā)明采用恒溫的方法更簡單，易操作，能使用 便宜、簡便恒溫儀器進行相關(guān)實驗研究。
[0054] 實施例2不同純化試劑純化DNA效果對比
[0055]甲基化人基因組的獲?。和瑢嵤├?