RNAi抗蘋果莖痘病毒表達載體及其在蘋果抗病育種中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物育種領(lǐng)域，具體涉及一種RNAi抗蘋果莖痘病毒表達載體及其在蘋 果抗病育種中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘋果是我國果樹的主栽樹種之一，栽培面積和產(chǎn)量均居于世界之首。但是，近年來 隨著果樹產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展和苗木調(diào)運的日益頻繁，病毒病的傳播日益嚴(yán)重。蘋果莖痘病毒 (ASPV)是生產(chǎn)中主要的潛隱性病毒之一，植株受到其侵染后樹勢衰弱，引起產(chǎn)量和果實品 質(zhì)的下降，部分植株表現(xiàn)為葉片反卷、木質(zhì)部莖痘斑、果實凹陷等，給果樹生產(chǎn)造成嚴(yán)重的 經(jīng)濟損失，目前尚無有效的化學(xué)防治方法。
[0003]近年來，蘋果生產(chǎn)上通常采用的仍是傳統(tǒng)的莖尖脫毒技術(shù)，通常包括營養(yǎng)系的初 選、試管苗莖尖培養(yǎng)、熱處理脫毒、病毒檢測、無毒苗快繁等幾個步驟。由于自然條件下病毒 的遺傳物質(zhì)RNA極易發(fā)生變異，這就使得已有脫毒苗木在栽培過程中難免還會受到病毒的 再次侵染，難以做到有效脫毒。
[0004]目前，通過基因工程培育抗病毒品種，已成為獲得抗病毒植物最為有效的技術(shù)途 徑，但目前果樹植物上通常采用的仍是直接利用病毒外殼蛋白基因進行轉(zhuǎn)化的傳統(tǒng)策略， 主要包括以下幾個步驟：（l)RT-PCR擴增獲得病毒基因的完整序列；（2)將目的基因插入表 達載體，構(gòu)建含有目的基因的過表達載體;（3)將過表達載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中；（4)用農(nóng)桿 菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植物獲得轉(zhuǎn)基因植株。該傳統(tǒng)策略操作繁瑣，要求苛刻，安全性尚得不到保 證。
[0005]RNA干擾(RNAi)是近年來發(fā)展起來的一種dsRNA介導(dǎo)的高頻、高效、高度特異的基 因沉默技術(shù)，可通過將外源dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞介導(dǎo)同源靶基因mRNA序列的降解，抑制靶基因的 表達，是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象。RNAi介導(dǎo)的植物抗病毒基因工程的原理是，利用 RNAi合成與病毒同源的dsRNA，并將其轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞內(nèi)，由植物體的RNAi機制對入侵病毒的 RNA進行特異性切割降解，從而保護植物體不受病毒危害。雖然，通過RNA干擾技術(shù)沉默病毒 外殼蛋白（CP)基因在某些作物(如大豆、煙草等)上已經(jīng)獲得了良好的抗病毒效果，由于蘋 果為多年生木本植物，與草本植物相比，利用基因工程進行抗病育種技術(shù)的發(fā)展水平明顯 滯后，因此在蘋果上應(yīng)用障礙較大，長期得不到實施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對以上問題，本發(fā)明提供一種RNAi抗蘋果莖痘病毒表達載體及其在蘋果抗病育 種中的應(yīng)用，獲得的轉(zhuǎn)基因植株具有抗病毒特性，在果樹生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。
[0007]為解決上述問題，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)： 一種抗蘋果莖痘病毒植株的育種方法，包括以下步驟： (l)RT-PCR擴增獲得目的基因片段： 根據(jù)病毒基因全長序列，在保守區(qū)段設(shè)計合成引物;提取感病材料的植物總RNA，通過 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，并以此為模板、利用所合成引物進行PCR擴增，獲得目的基因片段； 將目的基因片段切膠回收，連接至T載體，測序驗證； 優(yōu)選采用以下步驟： (1.1) 根據(jù)Genebank公布的ASPV病毒外殼蛋白基因全長序列，在保守區(qū)段設(shè)計、合成引 物， ASPV-F:5 '-CACCAGTTGCATTGATTGGGAT-3， ASPV-R:5 '-TCCAATTTTTCCCCCAGTGACT-3 '； (1.2 )用Trizo1法從感病的蘋果葉片中提取植物總RNA，取2yg純化的RNA，在M-MLV反轉(zhuǎn) 錄酶作用下，以隨機引物OligodT進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，再以此為模板，利用引物 ASPV-F、R以及pfu酶進行PCR擴增，PCR反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性3min; 32個循環(huán)的94°C變性 30s、57°C退火 30s、72°C延伸 90s;72°C延伸lOmin; (1.3)將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，然后將目標(biāo)條帶切膠回收，獲得含干擾片 段ASPV的平末端PCR產(chǎn)物，切膠回收后連接至PMD19-T載體，陽性克隆測序。
[0008] (2)RNAi抗蘋果莖痘病毒表達載體的構(gòu)建： 利用TOPO-Cloning技術(shù)構(gòu)建入門克隆載體，再利用LR反應(yīng)構(gòu)建RNAi抗蘋果莖痘病毒表 達載體； 優(yōu)選采用以下步驟： (2.1) 利用TOPO-Cloning技術(shù)構(gòu)建入門克隆載體：取含目的基因片段的PCR回收產(chǎn)物1 yL，構(gòu)建6yL反應(yīng)體系：回收目的基因片段ASPVlyL、平衡鹽溶液（saltsolution)lyL、 pENTRTM/SD/D_T0P0?載體lyL、滅菌超純水3yL，25°C反應(yīng)30min，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 T0P10感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞均勻涂布在含有50mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培 養(yǎng)16h后，挑單克隆到含有相同濃度卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)14h，分別 以ASPV-F與ASPV-R和Ml3-F與ASPV-R為引物進行菌液PCR擴增，PCR反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性 3min; 32個循環(huán)的94°C變性30s、57°C退火30s、72°C延伸90s; 72°C延伸lOmin;如果擴增片段 的長度明顯大于插入片段的長度，即為構(gòu)建好的入門克隆載體，命名為pENTR-ASPV; (2.2) 利用LR反應(yīng)構(gòu)建RNAi干擾載體:取pENTR-ASPV質(zhì)粒2yL，構(gòu)建20yLLR反應(yīng)體系： pENTR-ASPV2yL、pHELLSGATE12 2yL、LRclonaseenzymemix(LR酶）4yL、滅菌水 12yL， 25°C反應(yīng)12h后加入2yL蛋白酶K，37°C溫浴lOmin終止反應(yīng);反應(yīng)產(chǎn)物熱激法轉(zhuǎn)化大腸 桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞均勻涂布在含有100mg/L壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上， 37°C培養(yǎng)16h后挑單克隆到含有相同濃度壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)14h 后，分別提取LR反應(yīng)后的單克隆和pHELLSGATE12空載質(zhì)粒，先用ASPV-F和ASPV-R作引物進 行菌液PCR，陽性質(zhì)粒分別用Xbal和Xhol進行單酶切鑒定，將構(gòu)建好的RNAi抗蘋果莖痘病毒 表達載體命名為pH-ASPV; Xbal酶切體系為:XbaIlyL、10XMBuffer2yL、0.1%BSA2yL、LR反應(yīng)產(chǎn)物6yL、滅菌 超純水9yL;XhoI酶切體系為:XhoIlyL、10XHBuffer2yL、LR反應(yīng)產(chǎn)物6yL、滅菌超純水11 yL〇
[0009](3)將RNAi抗蘋果莖痘病毒表達載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌： 用凍融交替法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株，轉(zhuǎn)化后進行陽性克隆的篩選鑒定； 優(yōu)選采用以下步驟： (3.1) 用凍融交替法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株:用凍融交替法將質(zhì)粒pH-ASPV轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布在含有100mg/LSpc和50mg/L利福平的YEB平板培養(yǎng)基上，28°C倒置 培養(yǎng)2d，挑單克隆到含有相同濃度的壯觀霉素和利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C條件下震 蕩培養(yǎng)48h; (3.2) 轉(zhuǎn)化后陽性克隆的篩選鑒定:將pH-ASPV質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105后，分別用 ASPV-F與ASPV-R、P35S-F與ASPV-R以及ΝΡΤΠ-F與ΝΡΤΠ-R作引物進行菌液PCR擴增，如果用 ASPV-F與ASPV-R作引物PCR擴增出現(xiàn)493bp大小的片段，而以P35S-F與ASPV-R作引物的擴增 片段明顯大于干擾片段大小，且以ΝΡΤΠ-F與ΝΡΤΠ-R作引物擴增片段大小為714bp，說明 RNAi載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，即為可用于侵染植物的RNAi工程菌，命名為EH-ASPV。
[0010] (4)蘋果葉盤受體材料的無菌培養(yǎng)： 采集田間材料，并進行消毒處理，再進行無菌營養(yǎng)的繼代培養(yǎng)，以及葉盤的切割與預(yù)培 養(yǎng)； 具體包括以下步驟： 4月份采集當(dāng)年生幼嫩蘋果枝條，用流水沖洗2~4h，剪成約1.0~2.0cm長的莖段，先 用75%的酒精進行表面消毒，0.l%HgCl2水溶液浸泡lOmin，無菌水漂洗4~5次，接種在MS+6-BAO. 5mg//L培養(yǎng)基上，每4~5周繼代1次;取繼代培養(yǎng)15~20d的M26無菌苗，無菌條件下將頂 部幼嫩葉片從中部劃傷成部分連在一起的葉盤，在MS+6-BA4.Omg/L+NAAO. 2mg//L培養(yǎng)基上 進行預(yù)培養(yǎng)。
[0011] (5)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化蘋果獲得轉(zhuǎn)基因材料： 培養(yǎng)RNAi工程菌，將根癌農(nóng)桿菌侵染蘋果葉盤，然后，進行Kan抗性芽的篩選、繼代培 養(yǎng)； 具體包括以下步驟： 將上一步驟中的蘋果葉盤在MS+6-BA4.Omg/L+NAAO. 2mg//L培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2天后，將EH-ASPV菌液28°C震蕩培養(yǎng)至0D=0.5，6000rpm離心lOmin后收集沉淀的菌體，用等體積的MS 液體培養(yǎng)基重懸菌液，浸泡侵染葉盤10min后，用無菌濾紙吸干多余的菌液，接種在1^+6_ BA4 ·Omg/L+NAAO· 2mg/L培養(yǎng)基上暗培養(yǎng) 3d，轉(zhuǎn)至MS+6-BA4 ·Omg/L+NAAO· 2mg/L+Cef250mg/L 培養(yǎng)基上進行脫菌培養(yǎng)，7d后轉(zhuǎn)至MS+6-BA4 ·Omg/L+NAAO· 2mg/L+Kan50mg/L+Cef250mg/L 培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，切取獲得的抗性芽接種在MS+6-BA0 · 5mg/L+Kan50mg/L+Cef250mg/ L培養(yǎng)基上，每2周繼代一次，連續(xù)繼代3次后，將發(fā)育良好的抗性芽轉(zhuǎn)至1/2MS+NAA0.2+ Kan50mg/L+Cef250mg/L培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。
[0012] (6)轉(zhuǎn)基因植株的檢測： 對所得轉(zhuǎn)基因植株進行PCR初檢，然后進行Southern雜交檢測； 具體包括以下步驟： (6.1) PCR檢測:選取生根良好的Kan抗性植株，用CTAB法提取植物基因組DNA，用ASPV-F與ASPV-R作引物進行PCR擴增，在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳分析； (6.2)Southern雜交檢測:選取PCR檢測為陽性的植株進行Southern雜交，具體步驟為： (6.2.1)探針制備 采用PCR制備探針，PCR反應(yīng)體系為：10Xbuffer(含Mg2+ 15mmol/L) 5yL，dUTP標(biāo)記混 合物5yL，NPTII-FlyL，NPTII-RlyL，Taq酶lyL，陽性質(zhì)粒lyL，雙蒸水36μΙ^ΡΟ?反應(yīng)參數(shù) 為：94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸40s，共35個循環(huán)；72°C延伸lOmin； (6.2.2) 對基因組DNA和陽性質(zhì)粒進行酶切 基因組DNA酶切體系如下：10XMbuffer60yL，內(nèi)切酶HindIII，30yL，基因組DNA10μ L，滅菌水加至總體積為600yL;酶切后的DNA用等體積酚：氯仿抽提，產(chǎn)物溶于50yL去離子 水;質(zhì)粒酶切體系為：10XMbuffer5yL，內(nèi)切酶HindIII2.5yL，陽性質(zhì)粒2.5yg，滅菌水 加至總體積為50y