發(fā)狀根系繼代于新鮮培養(yǎng)基后，能夠很快恢復(fù)快速生長能力。
[0017] 5.花生發(fā)狀根白藜蘆醇的提取及檢測。
[0018] 花生發(fā)狀根白藜蘆醇的提取采用浸提法，檢測用HPLC方法進行，檢測用HPLC方法 進行，其中色譜條件為:色譜柱0DS，流動相乙腈:水=25:75，流速1.0mL/min，檢測波長306 nm，柱溫25°C，進樣量10yL〇
[0019] 6.液體培養(yǎng)基中白藜蘆醇的提取及檢測。
[0020] 液體培養(yǎng)基中白藜蘆醇的提取采用以乙酸乙酯為萃取劑的萃取法獲得，通過簡單 的萃取操作，白藜蘆醇溶解于乙酸乙酯中，以減壓濃縮的方法濃縮萃取液，即可獲得白藜蘆 醇粗提液。檢測用HPLC方法進行。其中色譜條件為:色譜柱0DS，流動相乙腈:水=25:75，流 速1.0mL/min，檢測波長306nm，柱溫25°C，進樣量10yL〇
[0021 ]本發(fā)明的優(yōu)點在于:本發(fā)明利用煙草根特異啟動子NtR12驅(qū)動AhRESS基因在煙草 根中特異表達，將植物表達載體經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化至花生中，使AhRESS基因在花生發(fā)狀根 中特異表達，通過1/2MS培養(yǎng)基于28°C，以120rpm的震蕩搖床中黑暗培養(yǎng)14d可實現(xiàn)發(fā)狀根 大量擴繁，實現(xiàn)白藜蘆醇的大量表達。獲得的發(fā)狀根中白藜蘆醇含量可提高0.8倍，含量達 至IJ148.62yg/g(FW)，同時培養(yǎng)基中白藜蘆醇為80.86yg/100mL，是花生本身根系白藜蘆醇 含量的7倍多。本發(fā)明為利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)花生發(fā)狀根進而生產(chǎn)白藜蘆醇奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0022]圖1花生發(fā)狀根生長曲線。
[0023] 圖2不同培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)狀根產(chǎn)量圖。
[0024] 圖3不同溫度下發(fā)狀根產(chǎn)量圖。
[0025]圖4不同濃度醋酸鈉處理花生發(fā)狀根中白藜蘆醇含量;P12，P2:不同轉(zhuǎn)基因發(fā)狀 根系，CK:陰性發(fā)狀根系對照。
[0026]圖5不同濃度醋酸鈉處理培養(yǎng)基中白藜蘆醇含量。P12，P2:不同轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根系，CK:陰性發(fā)狀根系對照。
【具體實施方式】
[0027]【實施例1】pBI121-NtRl2-AhRESS載體的構(gòu)建 1.煙草根特異啟動子NtR12的克隆 稱取約0.lg煙草葉片，置于研缽中用液氮凍融，迅速將其研磨成粉末;利用CTAB法提取 煙草中的DNA，用40yL10ng/yL的RNase無菌水溶解，置于37°C溶解lh左右。取lyL提取好的煙 草DNA點樣，進行電泳檢測，電泳條件：電泳緩沖液1XTAE，1.0%的瓊脂糖凝膠，電壓120V，電 泳時間約20min;同時取lyL用紫外分光光度計測定其濃度。
[0028]根據(jù)本實驗室前期克隆獲得的NtR12啟動子的拼接序列，設(shè)計引物財1?12-乂11〇1-primer-F(5'GCGCCGCTCGAGTAATACTACAATAATAATTAAG3'），NtR12-XbaI-primer-R(5'CGCTCTAGAGTTGTTGATATGTTTATGTTACTC3'），按照下列的PCR體系進行擴增。該體系包括 32.5yLddH20，10yLlOXPrimeSTARPCRBuffer(Mg2+plus)，4yLdNTPMixture(各 2.5mmol),lyLNtR12-XhoI-primer-F(10ymol),lyLNtR12-XbaI-primer-R(lOymol),1μ L煙草cDNA，0.5yLPrimeSTARHSDNApolymerase(2.5U/yL)，體系總體積為50yL。
[0029] 將50yL的PCR反應(yīng)體系混勻，均分為2管，每管各25μΙ^ΡΟ?反應(yīng)條件為:98°C5min ^(98〇C10s^53〇C15s^72〇C2min)5cycles^(98〇C10s^60°C15s^72〇C2min) 23cycles-72°C10min-4°C保存。
[0030]PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，連接至PMD18-TVector中，體系如下：5yL SolutionI，4.5yLDNA回收產(chǎn)物，0.5yLpMD18-TVector(50ngAxL)，該體系總體積 10yL。 將各成分分別加入200yL的PCR管中，混勻，16°C過夜連接，約16-24h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸 桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，搖菌后涂于含抗生素Amp的LB平板上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12-16h。挑取單克隆經(jīng)PCR檢測后送往華大基因進行測序，測序結(jié)果如SEQIDN0.1。測序結(jié) 果正確的重組質(zhì)粒即為pMD18-NtR12。
[0031] 2.花生白藜蘆醇合酶基因AhRESS的克隆 利用CTAB法提取花生葉片基因組DNA，以花生白藜蘆醇合酶基因特異引物六111^55-BamHI-primer-F( 5'TCGTGGATCCGCCACCATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC3'），AhRESS-SacI-primer-R(5'TCCTGAGCTCTTATATGGCCACACTGCGGAGAACG3'）進行PCR檢測。其回收產(chǎn)物即 為花生AhRESS基因編碼框DNA序列。通過連接酶構(gòu)建在pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受 態(tài)細(xì)胞DH5a中，挑選陽性克隆進行測序鑒定，測序結(jié)果如SEQIDN0.2。
[0032] 3.pBI121-NtR12-AhRESS載體的構(gòu)建 以pCAMBIA-1301載體質(zhì)粒為模板，用帶有限制性酶切位點的特異引物(61^?-8&111!1-Spe: 5 'agga-GGATCC-ACTAGTaccatggtagatctgagggtaaatttc3 ' Swal: 5'agga-gagctc-GGCGCGCCTAAATTTA-GAAATTCGAGCTGGTCACCTGT3'）進行PCR，其回收 產(chǎn)物即為克隆得到的GUSA基因。將pBI121載體利用BamHI和SacI進行酶切，切除該載體上的 GUSA基因，回收酶切后的載體條帶；將GUSA基因連接至酶切后的pB1121載體上，得到 PBI121-GUSA載體。
[0033] 將pMD18_NtR12載體利用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI進行酶切，酶切體系如下：2.0yg質(zhì)粒DNA，5.0yL10XKbuffer，2.0yLSacI，2.0yLBamHI，ddH20補至50yL，混勻，于37°C 消化酶切l(wèi)〇_12h，反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，回收目的條帶，獲得NtR12 啟動子。
[0034] 利用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI將pBI121-GUSA載體進行酶切，切除35S啟動子，酶 切體系如下：2.0yg質(zhì)粒DNA，5.0yL10XKbuffer，2.0yLSacI，2.0yLBamHI，ddH20補至50 yL，混勻，于37°C消化酶切l(wèi)lh，反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果。
[0035]將NtR12啟動子連接至切除35S啟動子的pBI121-GUSA載體中，連接反應(yīng)體系如下：l.OyL10XT4ligasebuffer，4.0yL基因DNA片段，4.0yL載體DNA片段，l.OyLT4DNA ligase，混勻，于16°C過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂布于含 抗生素Kan的LB平板上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14h。
[0036] 挑取單克隆進行菌液PCR檢測，PCR反應(yīng)體系如下：1.0yL模板，2.0yL10XPCR buffer，1 · 5yL2.5mMdNTP，0.1yL普通Taq酶，0.5yLNtR12-XhoI-primer-F，0.5yL 財1?12-父匕31-?411^^-1?，14.441^(1!12〇。？0?反應(yīng)條件為：94。〇5111丨114(94。〇3〇8453。〇3〇8 -72°C2min)5cycles-(94°C30s-60°C30s-72°C2min)30cycles-72°C10min-4°C 保存。對菌液PCR呈陽性的部分菌液進行擴繁，用堿裂解法提取質(zhì)粒，然后進行酶切單、雙檢 測，37°C酶切消化4h，反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳