轉(zhuǎn)錄因子cdxa調(diào)控雞腸道內(nèi)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白glut2表達(dá)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及轉(zhuǎn)錄因子⑶XA調(diào)控雞腸道 內(nèi)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2表達(dá)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 飼料轉(zhuǎn)化率是畜牧業(yè)衡量經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo)，是由基礎(chǔ)代謝、蛋白質(zhì)沉積、消化 能力、食欲、行為等多種性狀互作的結(jié)果，受遺傳、環(huán)境、性別和營(yíng)養(yǎng)組分比例等因素的影 響。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)控制飼料中各營(yíng)養(yǎng)組分的比例可以在一定程度上調(diào)節(jié)畜禽的飼料轉(zhuǎn) 化率，如增加飼料中能量、蛋白質(zhì)比例會(huì)提高飼料轉(zhuǎn)化率，但應(yīng)該注意的是，此舉同時(shí)也會(huì) 提尚伺養(yǎng)成本。
[0003] 在家禽養(yǎng)殖生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)過(guò)程中，飼料成本占生產(chǎn)成本中比例很大，約為70%，所以，將 優(yōu)質(zhì)飼料盡可能轉(zhuǎn)化為雞的體增重或產(chǎn)蛋量，或者在不影響雞產(chǎn)量的前提下，減少現(xiàn)有飼 料中某些營(yíng)養(yǎng)成分的比例以減少飼喂浪費(fèi)，在提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益方面起很重要的作 用。從長(zhǎng)遠(yuǎn)眼光看，在分子水平上，利用遺傳育種的方法是提高雞飼料轉(zhuǎn)化率的最終有效途 徑。
[0004] 腸道是雞消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的最主要場(chǎng)所，腸道的發(fā)育情況直接影響其對(duì)飼料中 營(yíng)養(yǎng)成分的吸收和利用，進(jìn)而影響雞的生長(zhǎng)速率與飼料轉(zhuǎn)化率。葡萄糖等糖類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是 機(jī)體內(nèi)主要的能源物質(zhì)，也是生物體內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)，具有重要的生物學(xué)功能。腸道對(duì)糖類(lèi) 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收過(guò)程主要由糖營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成，而糖營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)受多個(gè)轉(zhuǎn) 錄調(diào)控因子的調(diào)控。
[0005] 畜禽飼料轉(zhuǎn)化率的高低直接影響生產(chǎn)的投入與回報(bào)，而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中糖分的利用主 要源于腸粘膜上皮細(xì)胞中鈉/葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體（sodium/glucosecotransporter，SGLT)和 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體(glucosetransporter，GLUT)兩類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)載體共同協(xié)作完成。其中SGLT家族 中SGLT1通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸將腸道內(nèi)葡萄糖吸收轉(zhuǎn)運(yùn)至上皮細(xì)胞中，GLUT5通過(guò)易化作用將果糖 吸收到細(xì)胞中，而位于腸上皮細(xì)胞基底的GLUT2蛋白主要負(fù)責(zé)將胞內(nèi)的葡萄糖、果糖向組織 間隙液和血液中傳送，三種糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互協(xié)作完成機(jī)體對(duì)糖類(lèi)物質(zhì)的吸收。腸道糖運(yùn)輸 過(guò)程見(jiàn)圖1。
[0006] GLUT家族中GLUT2是一種生物體內(nèi)普遍存在的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。由524個(gè)氨基酸組 成，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)由12個(gè)跨膜的α螺旋組成，GLUT2基因位于3號(hào)染色體，定位于3q26.1 ~q26.3,共有11個(gè)外顯子。GLUT2是一個(gè)對(duì)葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖親和力不高的轉(zhuǎn) 運(yùn)體，但對(duì)葡萄糖胺有較高的親和力，且具有葡萄糖感受功能。有研究表明十二指腸同源框 蛋白（Pdxl)與神經(jīng)分化因子(NeuroDl)能共同誘導(dǎo)與β細(xì)胞功能相關(guān)的Nkx6.1轉(zhuǎn)錄因子和 GLUT2的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)的非結(jié)構(gòu)5A蛋白（NS5A)能降低GLUT2的啟動(dòng)子活性，Yamamoto等用 鏈脲菌素誘導(dǎo)大鼠致糖尿病模型中發(fā)現(xiàn)，低胰島素和高血糖水平能增加小腸和肝臟GLUT2 的表達(dá)，而在糖尿病小鼠胰腺中的GLUT2表達(dá)量顯著下降，這表明除了葡萄糖和胰島素外， 還有其他轉(zhuǎn)錄因子對(duì)GLUT2的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。Farrell等發(fā)現(xiàn)從各種草藥、香料、種子等 組成的草藥補(bǔ)充品中提取的多酚粗提液能夠減少腸細(xì)胞系Caco-2中葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，這一過(guò) 程通過(guò)與糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2的交互作用共同完成。Leturque等研究發(fā)現(xiàn)患有糖尿病的試驗(yàn) 小鼠體內(nèi)肝臟和內(nèi)分泌腺中GLUT2mRNA的表達(dá)量很高。Mace等研究發(fā)現(xiàn)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2 調(diào)控K細(xì)胞和L細(xì)胞內(nèi)腸肽的分泌，該腸肽能夠感應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物并為釋放GIP、GLP-1和PYY等內(nèi)分 泌素提供信號(hào)通路。Kellett等將試驗(yàn)小鼠小腸處于葡萄糖濃度不斷升高的環(huán)境中，研究發(fā) 現(xiàn)，為了滿足吸收高葡萄糖所需的能力，位于腸頂膜的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2的濃度和內(nèi)在活性 持續(xù)提高。這一現(xiàn)象由很多研究者利用小鼠、大鼠、肥胖病人等通過(guò)多個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)所證實(shí)。 Gu等以MIN6為研究模型發(fā)現(xiàn)，人參在腸道的中代謝化合物K通過(guò)上調(diào)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2基因 的表達(dá)顯著影響胰島素分泌。因此，糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2在小腸糖吸收中的作用十分重要，但 在雞的小腸中研究報(bào)道很少。
[0007]飼料中的碳水化合物只有在腸道被分解為單糖后才能被吸收，而且糖類(lèi)在家禽體 內(nèi)循環(huán)中的主要形式是葡萄糖、果糖、半乳糖。糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)糖類(lèi)物質(zhì)的吸收過(guò)程及其重 要。其中，葡萄糖易化轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT2主要表達(dá)于腎臟和小腸吸收上皮基底部的上皮細(xì)胞 內(nèi)，參與葡萄糖的吸收釋放或重吸收過(guò)程，在腸上皮細(xì)胞和血漿葡萄糖濃度之間發(fā)揮平衡 作用。George等研究發(fā)現(xiàn)在一些情況下GLUT2可轉(zhuǎn)運(yùn)至腸上皮細(xì)胞的頂膜而調(diào)節(jié)腸道對(duì)葡 萄糖的吸收。Cheeseman認(rèn)為位于基底膜的GLUT2同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖和果糖，它是目前已知的 唯一的一個(gè)對(duì)葡萄糖和果糖都具有轉(zhuǎn)運(yùn)能力的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。GLUT2介導(dǎo)的易化擴(kuò)散機(jī)制既 能使細(xì)胞吸收增強(qiáng)也不會(huì)消耗多余能量。
[0008]同源盒基因（homeoboxgene)是在果繩的研究中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)基因，對(duì)生物的器官 形成和細(xì)胞分化調(diào)控有著關(guān)鍵作用。在不同個(gè)體中其核酸序列中都含有一段180個(gè)堿基的 保守序列，編碼60個(gè)氨基酸，構(gòu)成一個(gè)多肽區(qū)域，因此稱(chēng)之為同源盒(homeobox)或同源結(jié)構(gòu) 域(homeodomain)(同源盒基因在胃腸道發(fā)育與胃腸道腫瘤發(fā)生中有作用）。根據(jù)基因的序 列及分布區(qū)域的不同，同源盒基因可以分為兩大家族:Η0Χ及PARAH0X家族，Η0Χ家族包含 Η0Χ-Α、B、C三個(gè)成員，PARAH0X則包含GSH、PDX和CDX。
[0009] CDX家族包括⑶X1、CDX2和⑶X4，CDX家族在小鼠發(fā)育時(shí)形態(tài)的形成過(guò)程中有重要 的作用。尾側(cè)型同源基因CDX1是屬于同源盒基因CDX家族的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，禽類(lèi)中稱(chēng)之為 CDXA，編碼260個(gè)氨基酸，含有三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子，蛋白定位于細(xì)胞核，與其他同源盒 基因一樣，⑶XA轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(He 1 i x-turn-he 1 iX)結(jié)構(gòu)識(shí)別并結(jié)合在受調(diào) 控基因的5'調(diào)控區(qū)序列，對(duì)下游基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。有研究表明，通過(guò)同源重組對(duì)小鼠⑶XI 基因進(jìn)行敲除，小鼠可以正常生長(zhǎng)，但其頸椎發(fā)生了前移的異?，F(xiàn)象。在小鼠胚胎直腸的形 成時(shí)期，⑶XA基因的異常表達(dá)可導(dǎo)致肛門(mén)直腸畸形(ARM)。現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外對(duì)⑶XA基因的研究主 要集中于胃癌與胃腸化生的預(yù)防和治療中。文獻(xiàn)報(bào)道，在正常胃黏膜中沒(méi)有CDXA基因的表 達(dá)，而在胃腸化生型組織中有CDXA基因的檢出，因此認(rèn)為CDXA轉(zhuǎn)錄因子能促進(jìn)上皮細(xì)胞的 分化成型。CDXA轉(zhuǎn)錄因子在雞的消化道中特異表達(dá)于十二指腸至直腸，主要集中在小腸與 小腸隱窩，而在其他正常的消化道中不表達(dá)。其促進(jìn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)分化，在消化道內(nèi)皮的脫 落補(bǔ)充過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。在某些表達(dá)CDXA蛋白的報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)中，含有CDXA元 件的載體能夠增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄活性。CDXA作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，特異表達(dá)于消化道的小腸中， 其勢(shì)必會(huì)對(duì)部分下游基因有調(diào)控作用。
[0010] 尾側(cè)型同源基因⑶XA是屬于同源盒基因⑶XA家族的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，主要控制腸上 皮細(xì)胞的增殖與分化，并有研究發(fā)現(xiàn)CDXA轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)能促進(jìn)葡萄糖-6-磷酸酶的表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)錄因子CDXA調(diào)控雞腸道內(nèi)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2表達(dá)的 方法。
[0012] 本發(fā)明由如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種轉(zhuǎn)錄因子CDXA調(diào)控雞腸道內(nèi)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 GLUT2表達(dá)的方法，包括構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子⑶XA的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-⑶XA，雞小腸上皮細(xì) 胞體外分離培養(yǎng)及鑒定，運(yùn)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法將真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至雞小腸上皮細(xì) 胞，轉(zhuǎn)染后收集雞小腸上皮細(xì)胞并獲得cDNA，絕對(duì)PCR熒光定量測(cè)定cDNA中目的基因CDXA的 表達(dá)量與糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因GLUT2的表達(dá)量。
[0013] 具體包括如下步驟： 1 ·構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3 · 1-⑶XA: A. 引物設(shè)計(jì):NCBI中查找雞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CDXA基因序列信息，按查到的基因序列應(yīng)用 Primed. 0進(jìn)行在線引物設(shè)計(jì)，在CDXA上下游引物的5'末端分別添加雙限制性酶切位點(diǎn) Hindlll和EcoRI;引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，其中AAGCTT和GAATTC為添加的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)； 表1引物
B. PCR擴(kuò)增相應(yīng)的基因片段：以雞小腸總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA第一鏈為模板，采用設(shè)計(jì) 好的PCR引物擴(kuò)增基因CDXA的相應(yīng)片段； C. PCR產(chǎn)物的純化回收、克隆與測(cè)序:按照北京全式金生物技術(shù)有限公司的割膠回收 試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化回收，純化得到的PCR產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化，擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液進(jìn)行測(cè)序， 測(cè)序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒的提取，用微量核酸測(cè)定儀測(cè)定質(zhì)粒的濃度和純度； D. pcDNA3.1-CDXA的制備：用Hindm與EcoRI分別酶切CDXA質(zhì)粒和pcDNA3.1質(zhì)粒，回收 之后，將兩者用T4DNA鏈接酶進(jìn)行4°C過(guò)夜連接； E. 重組子的轉(zhuǎn)化:所制備的pcDNA3.1-⑶XA連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)大腸桿菌DH5a中， 在PCR儀中42°C90s熱激反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將菌液中的菌體復(fù)蘇;復(fù)蘇后的菌體進(jìn)行液體 擴(kuò)大培養(yǎng)，然后將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌體測(cè)序； F. 質(zhì)粒的提取:測(cè)序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取;具體操作步驟參照Omega公司去內(nèi)毒素 質(zhì)粒提試劑盒。
[0014] 2.雞小腸上皮細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及鑒定：取15日齡雞胚，無(wú)菌操作取出小腸，去 除腸系膜分離小腸并清洗干凈小腸組織塊;采用嗜熱菌蛋白酶HEPES消化液進(jìn)行酶消化組 織塊，使其形成細(xì)胞玄燁，采用相差貼壁法培養(yǎng)雞小腸上皮細(xì)胞，培養(yǎng)好雞小腸上皮細(xì)胞接 種于細(xì)胞培養(yǎng)板，至于40°