表達h3n2犬流感ha蛋白的重組犬腺病毒疫苗載體的構建方法
【技術領域】
[00011本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體地，涉及一種表達H3N2犬流感HA蛋白的重組 犬腺病毒疫苗載體的構建方法。
【背景技術】
[0002] 2004年（Crawfordetal.，2005)首次在美國佛羅里達州獵狗身上分離到馬源 H3N8病毒，揭示該病毒可通過跨物種轉播。時隔一年，人類在犬身上發(fā)現(xiàn)H3N8犬流感。之后 幾年在歐美幾個國家均不間斷的出現(xiàn)H3N8犬流感，然而在亞洲板塊各國卻鮮見該亞型病的 流行。根據(jù)報道，在亞洲主要以H3N2亞型為主。2002年在南韓、2006年中國廣州等地先后報 道出H3N2犬流感，中國廣州華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院外科教研室，歷經10年不間斷地進行犬 流感流行情況進行跟蹤調查，結果顯示，在中國主要以H3N2犬流感流行為主，通過基因序列 比對發(fā)現(xiàn)，各流行病毒株的基因同源性極其高，毒力檢測均未見大幅變化，檢測發(fā)現(xiàn)TCID50 介于103~104之間。面對H5N1、H1N1在犬身上發(fā)現(xiàn)的個別案例，及各地逐年遞增的H3N2犬流 感流行病例，其流行控制仍是重點、不容小視。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明從本國國情出發(fā)，針對主要流行亞型H3N2病毒，開展疫苗研制的前期工作， 旨在提供一種表達H3N2犬流感HA蛋白的重組犬腺病毒疫苗載體，為犬流感防疫做出實施有 效的技術參考。
[0004]本發(fā)明的另一個目的是提供一種表達H3N2犬流感HA蛋白的重組犬腺病毒疫苗載 體的構建方法。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術方案予以實現(xiàn)的： 一種表達H3N2犬流感HA蛋白的重組犬腺病毒疫苗載體，在pP〇ly2-CAV2-AE3質粒的SalI和Nru頂每切位點之間插入SEQIDN0:2所示基因片段。
[0006] 一種表達H3N2犬流感HA蛋白的重組犬腺病毒疫苗載體的構建方法，包括如下步 驟： 51.PCR擴增獲得SEQIDN0:1所示的犬流感病毒H3N2亞型的HA基因序列； 52. 將權利要求1所述的HA基因插入pMD18-T質粒中，構建重組質粒pMD18-T-HA; 53. 同時雙酶切重組質粒pMD18-T-HA和pEGFP-Cl載體，酶切產物連接后構建重組質粒 pEGFP-Cl-HA； 54. 同時雙酶切重組質粒pEGFP-Cl-HA和pVAXE3載體，酶切產物連接后構建重組載體 pVAXE3-HA〇
[0007] 優(yōu)選地，PCR擴增的引物序列如SEQIDN0:3~4所示。
[0008]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果： 本發(fā)明將犬流感HA基因依次插入pMD18-T、pEGFP-Cl、pVAX-E3質粒后，成功將HA基因進 行修飾后，再將修飾后的HA基因片段重組到pP〇ly2-CAV2-AE3載體中，成功構建并獲得穩(wěn) 定遺傳的pP〇ly2-CAV2-HA疫苗載體，擴大了犬流感疫苗的研發(fā)市場，為后期犬流感疫苗的 研制及相關的基礎研究提供支持。
【附圖說明】
[0009]圖1為HA基因的PCR擴增產物的凝膠電泳圖，1為基因Marker，2為擴增產物條帶；3 為陰性對照。
[0010]圖2為PMD18-T-HA質粒酶切鑒定結果，1為Marker:6000bp;2，3為PMD18-T-HA經Nhe I和BamH I雙酶切結果;4為pMD18-T-HA質粒。
[0011]圖 3 為pEGFP-Cl-HA質粒酶切鑒定結果，1為Marker:6000bp; 2 為pEGFP-Cl-HA質粒 經AseI和MluI雙酶切結果；3為pEGFP-Cl-HA質粒。
[0012]圖4為PVAXE3-HA質粒酶切鑒定結果，1為NheI單酶切質粒;2為XhoI單酶切質粒； 3為PpuMI單酶切質粒;4、質粒；5、Marker:lkb;6、Marker: 2000bp〇
[0013]圖5為重組病毒pP〇ly2-CAV2-HA在MDCK細胞上的細胞病變（100X)。
[0014]圖6為重組病毒pPoly2-CAV2-HA的PCR鑒定，M、Marker: 2000bp; 1、CAV2 病毒DNA為 模版;2、H20為模版;3、重組病毒pPoly2-CAV2-HADNA為模版;4、重組pPoly2-CAV2-HA質粒 為模版。
[0015]圖7為電鏡觀察重組病毒pPoly2-CAV2-HA的病毒樣顆粒(68000X)。
[0016]圖8為間接免疫熒光檢測HA在重組病毒pPoly2-CAV2-HA中的表達，A:PBS感染MDCK; B:重組病毒pPoly2-CAV2-HA感染MDCK; C: CAV-2感染MDCK。
[0017]圖9為WB檢測HA在重組病毒pPoly2-CAV2-HA中的表達。
[0018]圖10為重組病毒pPoly2-CAV2-HA在MDCK中的病毒滴度穩(wěn)定性檢測。
[0019]圖11為HA基因在重組病毒pPoly2-CAV2-HA中的表達穩(wěn)定性檢測。
【具體實施方式】
[0020]下面結合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明做出進一步地詳細闡述，所述實施例 只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特 殊說明，均為常規(guī)方法;所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑 和材料。
[0021] 下列實施例中使用到的MDCK細胞購買于ATCC細胞庫，PVAXE3載體、pPoly2-CAV2-ΛΕ3載體由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院寄生蟲教研室袁子國老師惠贈;pMD18T載體購自大連寶 生物工程公司；感受態(tài)DH5a(天根)購自廣州真知生物有限公司。
[0022] 實施例1 1、HA基因的擴增:通過NCBI上ClVH3N2亞型的HA基因進行比對分析，選取同源系數(shù)較 高的一株病毒(Canine/Guangdong/1/2006(H3N2))為模版，設計HA基因的0RF序列擴增引 物。上游引物加入Nhe頂每切位點，下游引物加入BamH頂每切位點。
[0024]PCR擴增反應的體系和條件參考本領域常規(guī)的方法，PCR產物經凝膠電泳檢測后結 果見圖1，切膠回收PCR擴增產物，經測序正確后備用，HA基因的核苷酸序列如SEQIDN0:1 所示。
[0025] 2、pMD18T-HA重組質粒的構建及鑒定:配置下列反應:無菌水1.8UUPMD18-T載體 0.2uL、PCR擴增產物3.OyUSolutionI5uL，以上成分混勻后，16°C連接過夜，將連接產物 轉化感受態(tài)細胞DH5a，通過液態(tài)培養(yǎng)基擴繁，質粒提取試劑盒，獲得PMD18T-HA質粒，經Nhe I和BamHI酶切鑒定（圖2)并送件測序結果正確后進行后續(xù)實驗。
[0026] 3、pEGFP-Cl-HA重組質粒的構建及鑒定：用NheI和BamHI同時雙酶切pEGFP-Cl 載體和PMD18T-HA重組質粒，膠回收純化載體大片段和HA片段，載體大片段長約4000bp。通 過T4連接酶將酶切后的載體大片段和切下的HA片段16°C連接過夜，連接產物轉化感受態(tài)細 胞DH5a，通過液態(tài)培養(yǎng)基擴繁，質粒提取試劑盒，獲得PEGFP-C1-HA重組質粒，質粒經AseI 和MluI雙酶切鑒定（如圖3)，膠回收試劑盒回收酶切后的目的片段，經測序后發(fā)現(xiàn)酶切后 目的片段長2537bp，-20°C保存用于后續(xù)實驗。
[0027] 4、pVAXE3_HA重組質粒的構建及鑒定 去磷酸化及粘性末端補平：SspI酶切pVAXE3載體，獲得7003bp的線性化片段Λ PVAXE3。用小腸堿性磷酸酶CIAP進行去磷酸化。具體操作如下：目的片段1~20pmol、 10XCIAPbuffer5yL、CIAP(10~30U/yL)l~2yL、無菌水補齊到50yL，將該體系溶液置于37 °C水浴鍋30min;在加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25 : 24 : 1)混合液充分混勻后， lOOOOprm離心5min，棄掉上清，如此重復一次；加入氯仿/異戊醇（24:l)50yL充分混勾后， lOOOOprm離心5min，棄掉上清；依次加入5yL的3MNaAc、125μΙ^7_Κ乙酸，_20°C預冷30min， lOOOOprm離心10min，棄掉上清；加入200yL預冷的70%無水乙醇洗滌沉淀，lOOOOprm離心 10min，棄掉上清，如此重復一次;超凈臺中自然晾干;用15tiL的無菌水溶解沉淀。-20°C存儲 備用。
[0028] 步驟3中回收的2537bp的目的片段含有"CMV-HA-polyA"。用KlenowFragment酶進 行補粘性末端。具體操作如下25uL體系：目的片段25ng，無菌水補齊到19uL后，依次加入 10)(KlenowFragmentbuffer2.5yL、dNTP2.5yL、KlenowFragmentlyL，將該體系溶液置 于37°C水浴鍋3h;在轉入65°C水浴鍋5min;用無水乙醇沉淀法收集去磷酸化片段。-20°C存 儲備用。
[0029]連接:將平端處理的"CMV-HA-polyA"片段與去磷酸化的ApVAXE3按照摩爾數(shù)比值 為1:1的比例混合，在T4連接酶的作用下，16°C連接過夜，將連接產物轉化感受態(tài)細胞DH5a， 通過液態(tài)培養(yǎng)基擴繁，質粒提取試劑盒，獲得PVAXE3-HA重組質粒。分別用NheI、XhoI、 卩口11]\11酶切鑒定（圖4)，他6 1酶切得到42526?、21776?、12886?、14326?、3976?片段411〇1 酶切得到6100bp、2446bp、1000bp片段；PpuMI酶切得到4396bp、2424bp、1795bp、381bp、 332bp、172bp、36bp片段。將鑒定正確的質粒送樣測序。
[0030] 5、pPoly2-CAV2-HA的構建及鑒定:pVAXE3-HA與pPoly2-CAV2-A