利用家蠶絲腺生物反應(yīng)器合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種家蠶合成分泌外源蛋白的方法，尤其是涉及利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一 種利用家蠶絲腺生物反應(yīng)器合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蜘蛛種類繁多，至今在全世界已命名的蜘蛛有112個科，3905個屬，44000多種。蜘 蛛絲是由蜘蛛絲腺分泌的一種天然高分子蛋白纖維，具有優(yōu)良的機(jī)械性能，如彈性好、強(qiáng)度 大、韌性強(qiáng)、耐高溫和低溫、耐沖擊、比重小、生物相容性好、以及生物可降解等優(yōu)良特性，其 獨特的綜合性能是其他天然纖維和合成纖維所無法相比的。典型的蜘蛛絲有7種類型，分別 由7種不同絲腺分泌的不同的蛋白質(zhì)分子組成。其中由大囊狀腺(Majorampullategland) 分泌的主牽引絲(draglinesilk)，呈放射狀分布，構(gòu)成蜘蛛網(wǎng)基本框架。牽引絲的強(qiáng)度是 鋼的5倍，因而擁有"生物鋼"之美譽。牽引絲的蛋白基因是高度保守的，主要由分子量 350kDa左右的、成對的牽引絲蛋白l(MaSpl)和牽引絲蛋白2(MaSp2)2種蛋白組成。
[0003] 黑寡婦蜘蛛(Latrodectushesperus)牽引絲蛋白2(MaSp2)基因具有一個單一外 顯子，全長11340bp，編碼3779個氨基酸，基因含有大量的重復(fù)單元，每一個重復(fù)單元主要由 2種初級類型重復(fù)序列以Typel-Typel-Typd串聯(lián)而成，而每一種初級類型重復(fù)序列都包含 了典型的An、GPGXX和GGX蛋白基序。堿基和蛋白序列如SEQIDN0.1和SEQIDNOJJaSp〗 被認(rèn)為是牽引絲具有很強(qiáng)韌性的主要分子基礎(chǔ)。
[0004] 由于蜘蛛絲自身的產(chǎn)量低，且由于其相互殘殺而不能通過大規(guī)模的飼養(yǎng)獲得批量 的蜘蛛絲，所以限制了蜘蛛絲的廣泛應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展和對蜘蛛絲的編碼序 列及吐絲機(jī)理的深入了解，已有采用各種異源表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)蜘蛛絲蛋白的研究，異源表 達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌、酵母(Pichiapastoris)、昆蟲細(xì)胞(sf9、BmN)、倉鼠的腎臟細(xì)胞、轉(zhuǎn) 基因土豆、轉(zhuǎn)基因煙草、轉(zhuǎn)基因山羊、轉(zhuǎn)基因老鼠、以及轉(zhuǎn)基因家蠶。
[0005] 但是，至今為止使用的各種異源表達(dá)系統(tǒng)都沒有表達(dá)過蜘蛛牽引絲蛋白2,現(xiàn)有技 術(shù)缺少了一種方法能分泌出盡可能長的、單一蜘蛛牽引絲蛋白2分子的蜘蛛絲。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決【背景技術(shù)】中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提出了一種利用家蠶絲腺生 物反應(yīng)器合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2的方法，利用轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù)將黑寡婦蜘蛛牽 引絲蛋白2基因?qū)爰倚Q基因組內(nèi)，并在家蠶絲腺細(xì)胞中特異表達(dá)，開發(fā)出能合成分泌單一 的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2的家蠶，獲得以家蠶絲為本底的黑寡婦蜘蛛牽引絲，用于蜘蛛絲 的開發(fā)利用，同時也可以用于提高蠶絲的機(jī)械性能。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案的步驟如下：
[0008] (1)采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建pBac[3XP3-DSRed]-MaSp2質(zhì)粒作為在家蠶絲腺中表 達(dá)的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因載體，pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2質(zhì)粒（如圖1所示）以 piggyBac轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)包含外源基因的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因和作為標(biāo)記基因的紅 色熒光DsRed基因表達(dá)框；
[0009] (2)采用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶方法將pBaC[3XP3-DSRed]-MaSp2質(zhì)粒及能夠提供 piggyBac轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒pHA3PIG按濃度比1:1的比例導(dǎo)入家蠶產(chǎn)卵后6小時以內(nèi)的受精 卵內(nèi)，利用pBac[3xP3-DsRed]_MaSp2質(zhì)粒中的piggyBac轉(zhuǎn)座子將黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2 基因插入到家蠶基因組內(nèi)；
[0010] (3)蠶卵孵化后飼養(yǎng)至成蟲，然后與非轉(zhuǎn)基因家蠶交配制種續(xù)代，此代為G1代，在 G1代蠶卵的轉(zhuǎn)青期，通過熒光體視顯微鏡觀察篩選出單眼表達(dá)紅色熒光DsRed標(biāo)記基因的 轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲再與非轉(zhuǎn)基因家蠶交配制種續(xù)代成為G2代；
[0011] (4)G2代家蠶采用單蛾育，篩選出熒光體視顯微鏡下表達(dá)紅色熒光DsRed標(biāo)記基因 的家蠶，采用同蛾區(qū)蠶蛾相互交配制成G3代；
[0012] (5)G3代家蠶采用單蛾育，同蛾區(qū)表達(dá)紅色熒光DsRed標(biāo)記基因的蠶蛾相互交配， 制成G4代；
[0013] (6)從G4代開始并經(jīng)連續(xù)3代采用紅眼表型純一的蛾區(qū)飼養(yǎng)、單蛾育和同蛾區(qū)蠶蛾 交配的相同方法進(jìn)行選擇和交配，育成紅眼基因和黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因純合、絲腺 細(xì)胞能夠合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2的轉(zhuǎn)基因家蠶；
[0014] (7)通過家蠶絲腺細(xì)胞合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2,并隨家蠶吐絲結(jié)繭行為 進(jìn)入蠶繭。
[0015] 所述的質(zhì)粒pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2是以piggyBac轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)并帶有Amp抗性 基因，包括piggyBac轉(zhuǎn)座子的兩個轉(zhuǎn)座臂和TOR，以及兩個轉(zhuǎn)座臂之間的兩個功能表達(dá) 框，一個功能表達(dá)框是3XP3啟動子啟動的紅色熒光蛋白基因表達(dá)框，S卩3XP3Promoter-DsRed-SV40,另一個功能表達(dá)框是包含家蠶絲素蛋白重鏈基因啟動子、絲素蛋白重鏈基因 信號肽、黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因和家蠶絲素蛋白重鏈基因3'末端的表達(dá)框，即 FibroinHchainPromoter-FibroinHchainsignalpeptide-MaSp2_FibroinHchain PolyA〇
[0016]所述的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因是包含3倍到24倍的MaSp2基因重復(fù)單元 Typel-Typel_Type4(如圖 1 所示）。
[0017] 所述步驟(7)的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因在家蠶絲腺細(xì)胞特異表達(dá)，在家蠶絲 素蛋白重鏈信號肽的作用下分泌到絲腺腺腔，并隨吐絲行為分泌到蠶繭。
[0018]本發(fā)明是先構(gòu)建家蠶合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因的載體pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2,再利用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù)將這種質(zhì)粒與能夠提供piggyBac轉(zhuǎn)座酶的 輔助質(zhì)粒PHA3PIG質(zhì)粒(如圖2所示)一起導(dǎo)入到家蠶受精卵內(nèi)，依靠piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座 特性，使紅色熒光蛋白基因和黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因?qū)氲郊倚Q基因組內(nèi)，并得到穩(wěn) 定遺傳和表達(dá)，從而創(chuàng)制成一種能夠在家蠶絲腺細(xì)胞特異性合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋 白2的轉(zhuǎn)基因家蠶，自交使黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2基因純合，育成能分泌黑寡婦蜘蛛牽引 絲蛋白2的轉(zhuǎn)基因家蠶，然后利用該種家蠶合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2。
[0019]本發(fā)明具有的有益效果是：
[0020] 本發(fā)明借助熒光標(biāo)志基因篩選轉(zhuǎn)基因家蠶，這種轉(zhuǎn)基因家蠶能夠在家蠶絲腺細(xì)胞 特異地合成分泌黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2,黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2具有功能活性。本發(fā)明 開發(fā)了一種新型的黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2生產(chǎn)工藝，為大量生產(chǎn)黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白2 奠定了基礎(chǔ)，同時也為提高蠶絲的機(jī)械性能奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0021]圖1是家蠶后部絲腺細(xì)胞合成分泌重組黑寡婦牽引絲蛋白2的pBac [3 XP3-DsRed]-MaSp2 X 24質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
[0022]圖2是能夠提供piggyBac轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0024]本發(fā)明的實施例如下：
[0025]本發(fā)明的五個實施例中的pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2質(zhì)粒采用以下方式制備合成：[0026] A)先將家蠶絲素重鏈蛋白基因啟動子(Fib-H-P)連到pMD18-T simple(Takara)載 體，并和基本的含有A3啟動子和綠色熒光蛋白表達(dá)框的piggyBac質(zhì)粒piggy6212載體分別 經(jīng)過Xhol/Ncol雙酶切，膠回收重鏈啟動子序列部分與piggyBac載體骨架連接，獲得