其是在集中養(yǎng)殖區(qū)一旦臨床癥狀出現(xiàn) 危害是比較嚴(yán)重的，同時會造成一定的經(jīng)濟損失，以及對公眾健康構(gòu)成潛在威脅。VP1是SaV 的衣殼蛋白，不僅可以起到保護病毒核酸作用，而且可以同時誘發(fā)機體的體液免疫與細胞 免疫。到現(xiàn)在為止，沒有合適的細胞系對病毒進行培養(yǎng)，因此，還沒有疫苗成功地防治該病， 對更便宜和好免疫原性的PoSaV疫苗還有迫切的需求。此外，傳統(tǒng)的滅活疫苗改變了病毒的 抗原表位，從而降低了免疫原性并導(dǎo)致其他潛在問題。有一些VLP疫苗已經(jīng)得到商品化和商 業(yè)許可。這就意味著，新疫苗的開發(fā)顯得尤為迫切。
[0123] 本發(fā)明通過桿狀病毒表達系統(tǒng)在sf9細胞中成功產(chǎn)生了PoSaV的VLP。通過共聚焦 顯微鏡可以觀察到病變后的sf9細胞核變大，VP1蛋白主要在細胞質(zhì)中均勻分布。通過透射 電鏡可以明顯的觀察到胞內(nèi)組裝的SaV-VLP，與天然病毒粒子大小相近，并且模擬天然病毒 結(jié)構(gòu)。在動物實驗中，通過ELISA方法檢測到了特異性抗體的產(chǎn)生，說明VLP免疫仔豬，能夠 在第2次免疫后激發(fā)機體體液免疫，并在一定時間內(nèi)達到較高的抗體效價。
[0124] 病毒抑制實驗表明，注射了VLP的仔豬產(chǎn)生了中和抗體，免疫組所有仔豬均在3天 左右的時間抑制了病毒的侵染和復(fù)制，而對照組所有仔豬從第2天開始連續(xù)七天均排毒。中 和抗體是病毒進入細胞前破壞病毒顆粒的。從而表明，VLP刺激機體產(chǎn)生的中和抗體能夠阻 止機體組織與病毒表面的抗原結(jié)合，阻止病毒黏附靶細胞受體，防止侵入細胞，從而起到保 護的作用。本發(fā)明旨在研制出在短時間內(nèi)能夠產(chǎn)生高效價的中和抗體的疫苗。SaV-VLP疫苗 對于PoSaV的防治具有良好的前景，可以作為預(yù)防PoSaV的疫苗之一。
[0125] 對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可以根據(jù)以上的技術(shù)方案和構(gòu)思，作出各種想要的 改變和變形，而所有的這些改變和變形都應(yīng)該包括在本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種豬札幌病毒抗原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： S1以SaVCH430株的RNA為模板，通過RT-PCR擴增出全衣殼蛋白VP1基因； S2將步驟S1得到的VP1基因克隆到真核表達載體pFastBaC?HTB中，構(gòu)建陽性重組質(zhì)粒； S3將步驟S2中成功構(gòu)建的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到含有DH10桿狀病毒骨架的感受態(tài)細胞 中，然后通過含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素三種抗性的培養(yǎng)基篩選出陽性菌株，再通過 M13引物鑒定得到陽性重組桿狀病毒質(zhì)粒，命名為DH10-VP1; S4將步驟S3得到的陽性重組桿狀病毒質(zhì)粒DH10-VP1轉(zhuǎn)染sf9細胞，收集病變細胞上清 作為P1代病毒液，再將P1代病毒液感染sf9細胞，制備P2代病毒液； S5將P2代病毒液感染sf9細胞，72h后收獲細胞上清，通過蔗糖密度梯度離心純化，得到 豬札幌病毒VP1衣殼蛋白及病毒樣顆粒抗原。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬札幌病毒抗原的制備方法，其特征在于，步驟S1中，擴增VP1 基因的特異性引物序列如下： VPl-fw：57-CGGGATCCATGGAGGCGCCTGCCC-37 VPl-revj，-GCGTCGACTCATCGTGAGCTGTGAAGGGAC-3,。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬札幌病毒抗原的制備方法，其特征在于，步驟S2的具體方法 為： 2.1) 將步驟S1得到的VP1純化回收后與pMD19-Tsimple連接轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細胞 內(nèi)，挑取單個菌落培養(yǎng)后提質(zhì)粒進行PCR以及酶切鑒定，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為 VP1-Tsimple，并和載體pFastBac?HTB用BamHI和SalΤ'酶切，回收VP1和線性化載體 pFastBac?HTB； 2.2) 用T4連接酶將步驟2.1)的回收產(chǎn)物連接并轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細胞中，再進行酶切 和PCR鑒定，將初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行測序鑒定，并且將陽性的重組質(zhì)粒命名為 pFastBac?HTB-SaV-VPl〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬札幌病毒抗原的制備方法，其特征在于，步驟S3具體實施如 下： 3.1) 在冰上解凍DHlOBac感受態(tài)細胞； 3.2) 加入步驟S2最終成功構(gòu)建到的陽性重組質(zhì)粒至感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，然后冰 孵30分鐘，在42°C熱激細胞45秒后，立即轉(zhuǎn)移至冰上，冷卻2分鐘； 3.3) 添加900yL的室溫S. 0.C.培養(yǎng)基，37°C下，225rpm振蕩試管4小時； 3.4) 使用S.O.C.培養(yǎng)基制備10倍連續(xù)稀釋的步驟3.3)中得到的細胞，稀釋度分別為10 -'ΙΟ-2、10-3; 3.5) 將步驟3.4)中得到的各種稀釋度的細胞各取10(^1^分別接種在含有5(^8/1^卡那 霉素、7yg/mL慶大霉素、10yg/mL四環(huán)素、100yg/mLBluo-gal和40yg/mLIPTG的LB瓊脂板 上，37°C培養(yǎng)至由單個菌落生成并觀察藍白斑的生長情況，發(fā)生轉(zhuǎn)座后的DHlOBac因其LacZ 基因被插入失活，而使含有桿狀病毒質(zhì)粒(Bacmid)的大腸桿菌菌落成為白色;挑取單個白 色菌落提取重組桿狀病毒質(zhì)粒DNA，并用PCR的方法進行鑒定，引物為M13,鑒定正確的陽性 重組桿狀病毒質(zhì)粒命名為DH10-VP1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的豬札幌病毒抗原的制備方法，其特征在于，步驟S3中的M13 引物序列如下： M13-fw：57-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-37 Ml3-rev：57-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-37 〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬札幌病毒抗原的制備方法，其特征在于，步驟S4的具體方法 如下： 4.1) 使用不含添加劑的Grace昆蟲培養(yǎng)基將sf9細胞培養(yǎng)在直徑為15mm的培養(yǎng)皿上，室 溫貼壁1小時； 4.2) 混勻CellfectionII轉(zhuǎn)染試劑，取8yL稀釋于lOOyL不含添加劑的Grace培養(yǎng)基中， 輕輕混勻，室溫下放置30分鐘； 4.3) 取lyg步驟S3得到的陽性重組桿狀病毒質(zhì)粒稀釋于100yL不含添加劑的Grace培養(yǎng) 基中，輕輕混勻；然后將稀釋后的陽性重組桿狀病毒質(zhì)粒與步驟4.2)所得的稀釋的 CellfectionII混合，輕輕混勻并在室溫下孵育15-30分鐘，得到轉(zhuǎn)染混合物； 4.4) 逐滴將步驟4.3)中所得的轉(zhuǎn)染混合物加入至步驟4.1)室溫貼壁的細胞中，28°C孵 育細胞3-5小時； 4.5) 吸出轉(zhuǎn)染混合物加入2mL完全培養(yǎng)基在28°C孵育細胞72小時，直至觀察到病毒感 染現(xiàn)象； 4.6) 將培養(yǎng)基上清收集離心后作為P1代病毒液4°C避光保存或_80°C長期保存； 4.7) 將P1代病毒液感染sf9細胞，制備P2代病毒液。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬札幌病毒抗原的制備方法，其特征在于，步驟S5的具體方法 如下： 5.1) 將sf9細胞培養(yǎng)在175cm2細胞培養(yǎng)瓶中，并感染步驟S4中所得的P2代病毒液； 5.2) 將細胞凍融三次后超聲破碎，經(jīng)處理后的細胞裂解液在5000rpm離心30分鐘，離心 兩次后收集上清，經(jīng)過〇.45μπι的濾器過濾，離心后收集上清，并分別加入lmL上清至2mL 20%、2mL30%、3mL45%、3mL60%的蔗糖密度梯度中，35000rpm4°C離心3小時，得到的產(chǎn) 物即為豬札幌病毒VP1衣殼蛋白及其病毒樣顆?？乖?VLPs)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬札幌病毒抗原的制備方法，以SaV？CH430株的RNA為模板，通過RT-PCR擴增出全衣殼蛋白VP1基因，將其克隆到真核表達載體pFastBacTMHTB中，并將成功構(gòu)建的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有DH10桿狀病毒骨架的感受態(tài)細胞中，通過含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素三種抗性的培養(yǎng)基篩選出攜帶SaV？VP1基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒的細胞，將獲得的攜帶SaV？VP1基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9細胞得到P1代桿狀病毒和P2代桿狀病毒，將P2代病毒液感染sf9細胞，72h后收獲細胞，獲得豬札幌病毒VP1衣殼蛋白以及組裝的病毒樣顆?？乖?VLP)，VLP與PoSaV天然病毒結(jié)構(gòu)相似。通過本發(fā)明可以獲得PoSaV？VP1蛋白及其VLP抗原，為亞單位疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N7/04, C07K14/08, C12N15/866
【公開號】CN105463023
【申請?zhí)枴緾N201510980012
【發(fā)明人】蘭喜
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年12月24日