一種高肌肉量及肥厚型心肌病模型克隆豬的制備方法
【技術領域】
[00011本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地說，涉及一種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)及雙Cas9n技術進行的Trim63基因的修飾。
【背景技術】
[0002] 肌肉由肌纖維組成，動物在出生后肌纖維的數(shù)量基本保持不變，因此肌肉大小主 要取決于肌纖維的大小。而肌纖維的大小取決于肌纖維細胞內蛋白質的合成與降解的平 衡：當?shù)鞍踪|合成大于降解時，肌纖維表現(xiàn)為肥大，反之當?shù)鞍踪|降解大于合成時，肌纖維 則表現(xiàn)為萎縮。
[0003] 作為肌肉特異表達的E3泛素連接酶，三結構域蛋白63(tripartitemotif-containing63，Trim63) 和F-box蛋白32(F-boxprotein32，F(xiàn)bxo32) 調控了絕大多數(shù)肌衆(zhòng) 蛋白和肌肉生長調控因子的降解。Trim63和Fbx〇32于2001年被發(fā)現(xiàn)在幾乎所有的肌肉萎縮 的模型中都明顯上調，并且在人和大鼠中都只在骨骼肌和心臟中表達。在Trim63和Fbx〇32 敲除后，小鼠都表現(xiàn)出顯著的抗肌肉萎縮的能力，并且在生長和繁殖方面表現(xiàn)完全正常。但 是對于敲除TRIM63后肌肉量變化并無系統(tǒng)研究。
[0004] 有研究表明，小鼠雙等位基因敲除Trim63和Trim55之后，能夠表現(xiàn)自發(fā)的心肌病。 但是當小鼠的四個等位基因中的一個尚未缺失時（Trim63v7/trim55+/_STrim63v_， TrimSS-A)，敲除鼠與野生鼠無異（WillisMSetal.Muscleringfinger1andmuscle ringfinger2arenecessarybutfunctionallyredundantduringdevelopmental cardiacgrowthandregulateE2Fl_mediatedgeneexpressioninvivo.Cel1 BiochemFunct· 2014Jan; 32( 1): 39-50 ·doi: 10 · 1002/cbf· 2969 ·Epub2013Mar20 ·)。而單 獨缺失Trim63雙等位基因的小鼠，需經過主動脈縮窄術才能誘導出心肌肥大的癥狀，若未 經手術，貝丨』無法出現(xiàn)Trim63-Z-鼠的病理表型(WillisMS，IkeC，LiL，etal.Musclering finger1,butnotmuscleringfinger2,regulatescardiachypertrophyin vivo.CircRes. 2007; 100:456-9.)。這與人類發(fā)生肥厚型心肌病的機理有極大的不同。
[0005] 而對于豬等大動物，目前尚未有Trim63基因對于肌肉量的維持以及肥厚型心肌病 的功能方面的研究。
[0006]豬作為主要家畜之一，由于存在肉類市場方面的需求，需要制備高肌肉量克隆豬。 而豬的心臟結構與人類幾乎一模一樣，是人類心血管研究中最重要的一種模式生物，構建 肥厚型心肌病疾病模型有助于人類加深對該類疾病的認識，從而提供更多更好的治療方 案。因此，亟需一種能夠獲得該模型克隆豬的方法。

【發(fā)明內容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供Trim63基因在制備高肌肉 量及肥厚型心肌病模型克隆豬中的應用以及一種高肌肉量及肥厚型心肌病表型的克隆豬 的制備方法。
[0008] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術方案如下：
[0009] 第一方面，本發(fā)明提供Trim63基因在制備高肌肉量及肥厚型心肌病模型克隆豬中 的應用。
[0010]所述應用為將修飾豬Trim63基因的體細胞作為核移植供體細胞，卵母細胞為核移 植受體細胞，通過體細胞核移植技術獲得克隆胚胎;將克隆胚胎移入豬子宮內妊娠即可獲 得Trim63基因修飾后的高肌肉量及肥厚型心肌病模型克隆豬，無需再對克隆豬進行主動脈 縮窄術等人工干預手段。
[0011] 第二方面，本發(fā)明提供一種高肌肉量及肥厚型心肌病表型的克隆豬的制備方法， 所述方法包括如下步驟：
[0012] 1)根據(jù)特異性靶向Trim63基因第一外顯子的sgRNA，構建針對Trim63基因第一外 顯子靶點的打靶載體;所述豬Trim63基因第1外顯子的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，所 述sgRNA的DNA序列如SEQIDN0.2和/或SEQIDN0.3所示；
[0013] 2)將所述打靶載體轉入豬成纖維細胞，獲得陽性細胞克??；以陽性細胞為核移植 供體細胞，卵母細胞為核移植受體細胞，通過體細胞核移植技術獲得克隆胚胎;將克隆胚胎 移入豬子宮內妊娠獲得Trim63基因修飾后的高肌肉量及肥厚型心肌病模型克隆豬。
[0014] 可選的，所述打靶載體為CRISPR/Cas9打靶載體或成對Cas9n打靶載體。優(yōu)選使用 成對Cas9n打靶載體，其能更大面積的造成Trim63基因第一外顯子的插入突變，使該基因發(fā) 生移碼突變，造成終止密碼子提前出現(xiàn)于第一外顯子，從而翻譯出一個截短的突變蛋白，達 到基因敲除的目的。
[0015] 當所述打靶載體為CRISPR/Cas9打靶載體時：
[0016] 所述CRISPR/Cas9打靶載體的構建方法為：
[0017] 1)將SEQIDN0.4和SEQIDN0.5所示序列進行互補配對，形成雙鏈DNA;
[0018] 2)將PX330骨架載體用限制性內切酶Bbsl進行酶切過夜，回收后，與步驟1)得到的 雙鏈DNA連接，即得；
[0019]或：
[0020] 1)將SEQIDN0.6和SEQID從).7所示序列進行互補配對，形成雙鏈0嫩；
[0021] 2)將px330骨架載體用限制性內切酶Bbsl進行酶切過夜，回收后，與步驟1)得到的 雙鏈DNA連接，即得。
[0022]當所述打靶載體為成對Cas9n打靶載體時，需按物質的量1:1的比例混合后，轉入 豬成纖維細胞。
[0023]所述成對Cas9n打祀載體的構建方法為：
[0024] 1)將SEQIDN0.4和SEQID從).5所示序列進行互補配對，形成雙鏈0嫩；
[0025] 2)將SEQ IDN0.6和SEQ IDN0.7所示序列進行互補配對，形成雙鏈DNA;
[0026] 3)將px335骨架載體用限制性內切酶Bbsl進行酶切過夜，回收后，分別與步驟1)和 步驟2)得到的雙鏈DNA連接，即得。
[0027]其中，所述px330骨架載體和px335骨架載體為本領域常規(guī)載體，可購自Addgene公 司。
[0028]作為優(yōu)選，本發(fā)明提供一個最佳的互補配對反應程序，具體為:94°C變性5min，35 °C退火lOmin，0~4°C保存?？蛇x的，可將反應物放置在冰上進行保存。
[0029] 進一步地，所述打靶載體轉入豬成纖維細胞的方法為，將打靶載體用電擊轉染或 脂質體轉染的方法轉入豬成纖維細胞。
[0030] 所述打靶載體轉入豬成纖維細胞的比例為:每1X106個豬成纖維細胞轉入打靶載 體4_6yg。
[0031] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0032] 本發(fā)明提供了Trim63基因在制備高肌肉量及肥厚型心肌病模型克隆豬中的應用。 將修飾豬Trim63基因的體細胞作為核移植供體細胞，卵母細胞為核移植受體細胞，通過體 細胞核移植技術獲得克隆胚胎;將克隆胚胎移入豬子宮內妊娠即可獲得Trim63基因修飾后 的高肌肉量及肥厚型心肌病模型克隆豬，無需再對克隆豬進行主動脈縮窄術等人工干預手 段，提高了構建疾病模型的便利性。
[0033] 本發(fā)明還首次在大動物上利用成對Cas9n打靶載體對大動物進行基因編輯，該方 法成本低，大幅縮短獲得純合子豬的時間，為大動物利用CRISPR/Cas9技術進行基因功能研 究及疾病模型建立奠定了基礎。
【附圖說明】
[0034]圖1是本發(fā)明實施例1中T7E1酶切法鑒定在豬胚胎成纖維細胞上px330質粒對基因 組的切割情況，PM1和pM9分別表示本發(fā)明獲得的兩個px330質粒。
[0035]圖2是本發(fā)明實施例2中T7E1酶切法鑒定在豬胚胎成纖維細胞上成對px335質粒對 基因組的切割情況，pMln和pM9n分別表示本發(fā)明獲得的兩個px335質粒。
[0036]圖3是本發(fā)明實例4中，針對克隆豬Trim63基因第1外顯子插入的83bp的測序峰圖。 峰圖單一無明顯雜峰，說明克隆豬Trim63基因為純合突變。
【具體實施方式】
[0037] 下面將結合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領域的技 術人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。
[0038] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040]其中：px330載體、px335載體購于Addgene公司；T4DNA連接酶、限制性內切酶購于 大連TaKaRa公司；引物合成及序列測定由深圳華大和北京美吉完成;KOD DNA聚合酶購于上 海東洋紡公司；T7E1酶購于NEB公司；質粒去內毒素大提試劑盒、膠回收試劑盒購于Omega公 司;基因組提取試劑盒購于QIAGEN公司；酶切、連接、回收、轉化、PCR擴增等常規(guī)實驗操作步 驟詳見《分子克隆(第三版)》。
[0041 ] 實施例1CRISPR-Cas9打靶載體的構建
[0042] 1、利用張鋒實驗室網站（http://crispr·genome-engineering.org/)對豬Trim63 基因第1外顯子的打靶位點進行預測。根據(jù)自我評估和預測結果中的評分，從候選的靶位點 中選擇兩個，命名為pMl、pM9，其sgRNA序列分別為TGGGAACCCCATGGAGAACC(SEQIDN0·2)和 TGACTTATAATCCATATTGT(SEQID勵.3)。根據(jù)881?熟序列合成互補配對的寡聚核苷酸，如表1 所示，其中小寫字母為酶切位點。
[0043]表1寡聚核苷酸序列
[0045] 2、共構建2個打靶載體，命名為ρΧ330-ρΜ1、ρχ330-ρΜ9,分別使用表1的兩對寡聚核 苷酸，構建過程如下:94°C，5min，再35°C，10min，然后立即放冰上。px330骨架載體用限制性 內切酶Bbsl進行酶切過夜，回收后，與退火的寡聚核苷酸16°C連接3h。通過常規(guī)轉化法進行 轉化、涂板。待單菌落長成后，挑取數(shù)個擴大培養(yǎng)并測序。測序驗證正確，說明本發(fā)明成功構 建兩個CRISPR-Cas9打靶載體。
[0046] 3、陽性單菌落擴大培養(yǎng)
[0047]具體步驟為:a.初始培養(yǎng)，用槍頭挑取陽性單菌落，加入盛有5mlLB培養(yǎng)基(胰蛋 白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g溶于1L蒸餾水中）的滅菌管中，37°C，220rpm，培養(yǎng)8h至 12h;b.擴大培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)液按體積1:500的比例轉移到盛有100mlLB培養(yǎng)基的滅菌三 角瓶中，37°C，220rpm，培養(yǎng) 12h至 16h;
[0048] 4、px330質粒去內毒素大提
[0049] 按照質粒去內毒素大提試劑盒(EndoFree Plasmid Maxi Kit)上提供的方法，提 取px330質粒，所提的質粒用于細胞的轉染。
[0050] 5、細胞轉染
[0051]細胞轉染采用Lonza Nucleofector進行電轉。具體流程如下:a.將消化并收集的6 孔細胞培養(yǎng)板中一個孔的豬成纖維細胞（約1X1〇6個）、4ygpx330質粒和100μ1 Nucleofector試劑混勾，裝入電擊杯用Τ-016程序進行電擊轉染;b.電擊結束后，沿電擊杯 內壁緩慢加入37°C預熱的成纖維細胞培養(yǎng)基（10%FBS+DMEM)500yL，將細胞接種于6孔細胞 培養(yǎng)板的一個孔內；c.用無篩選藥物的成纖維細胞培養(yǎng)基（10%FBS+DMEM)于37.5°C，5% C0