一種酶法再生atp的方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物化工領域，特別涉及一種酶法再生ATP的方法。
【背景技術】
[0002] ATP是生物體內(nèi)最重要的高能磷酸化合物，在醫(yī)學上被廣泛用作肌肉萎縮、心肌梗 塞、肝炎和各種急救病癥中的治療或重要輔助治療藥物。工業(yè)上也有許多重要的生物活性 物質(zhì)或生化藥物的生物合成過程，也都是需要ATP參加的酶促反應。所以，ATP的生產(chǎn)以及工 業(yè)上ATP的循環(huán)再生成為酶工程發(fā)展的一個重要問題，是決定工業(yè)生產(chǎn)是否經(jīng)濟節(jié)約的關 鍵因素。
[0003]近年來，對ATP再生的研究主要在多聚磷酸激酶催化法，即以ADP和多聚磷酸為底 物，由多聚磷酸激酶催化產(chǎn)生ATP。對于不同來源的多聚磷酸激酶，催化特點各不相同。如 Thermotoga11^1'；[1:;[1]^來源的多聚磷酸激酶16?口1^是一種嗜熱酶，它的最適溫度為70度，適 合參與溫度較高的反應，但在多數(shù)常溫酶的最適溫度(30~37度)條件下酶活較低，不能與 常溫酶的耦合反應，因此不能廣泛的滿足工業(yè)生產(chǎn)需求。還有一些多聚磷酸激酶，雖然最適 溫度在30度左右，但是利用的多聚磷酸鹽聚合度較高，這種聚合度高的聚磷酸鹽在當前在 市場上不易得到而且價格昂，這就提高了生產(chǎn)難度和生產(chǎn)成本。另一方面，就工業(yè)大量生產(chǎn) ATP而言，一些多聚磷酸激酶會受到多聚磷酸鹽的抑制，所以大規(guī)模生產(chǎn)時不得不采用流加 多聚磷酸鹽的方法來減少抑制，使生產(chǎn)過程變得繁瑣。所以現(xiàn)在亟需找到一種合適的多聚 磷酸激酶，使它既能與許多常溫酶耦合參與工業(yè)生產(chǎn)，又能夠使用比較常見且價格低廉的 多聚磷酸鹽為磷酸供體，使ATP再生過程方便、廉價、高效。
[0004] 與公知技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0005] 1)反應最適溫度為30~37度，符合工業(yè)生產(chǎn)上多數(shù)常溫酶的溫度要求，應用范圍 廣泛。
[0006] 2)磷酸供體為低聚合度的多聚磷酸鹽，相比聚合度為65或者更高聚合度的多聚磷 酸鹽，這些低聚合度的多磷酸鹽價格低廉且常見易得，使ATP再生過程經(jīng)濟、方便。
[0007] 3)沒有聚磷酸鹽抑制現(xiàn)象，能在較高濃度的多聚磷酸底物作用下高效生產(chǎn)ATP。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種異源表達的聚磷酸激酶，以低聚合度的多聚磷酸鹽為 磷酸供體，在聚磷酸激酶的催化條件下生成ATP，為多種消耗ATP的酶促反應源源不斷的提 供能量。
[0009] 本發(fā)明首先構(gòu)建基因工程菌，異源表達來自谷氨酸棒狀桿菌的多聚磷酸激酶基 因。即將基因ppk克隆至原核表達載體pET28a中得到多聚磷酸激酶基因表達載體pET28a-ppk。然后將表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，IPTG誘導表達，即可在胞內(nèi)獲得多聚磷酸 激酶。
[0010] 蛋白表達后，通過超聲破碎將大腸桿菌中的多聚磷酸激酶釋放出來，獲得粗酶液。 在三聚磷酸、四聚磷酸或者六偏磷酸或其鈉鹽為磷酸供體的條件下，以ADP為底物粗酶液催 化產(chǎn)生ATP。
[0011]本發(fā)明提供的方法，以ADP為底物，利用價格低廉的三聚磷酸、四聚磷酸和六偏磷 酸為磷酸供體，異源表達多聚磷酸激酶催化產(chǎn)生ATP，為經(jīng)濟高效生產(chǎn)ATP并在此基礎上降 低多種酶促反應的成本提供了一種創(chuàng)造性的方法。
[0012]圖1:DNA瓊脂糖凝膠電泳。左側(cè)為多聚磷酸激酶基因ppk的PCR產(chǎn)物，右側(cè)為DNA大 小標準品。
[0013] 圖2:pET28a-ppk質(zhì)粒圖譜，將ppk基因克隆到pET28a載體上，基因的兩端有Ncol和 EcoRI酶切位點。
[0014] 圖3:誘導表達多聚磷酸激酶PPK蛋白電泳圖。泳道1為pET28a空質(zhì)粒表達后破胞上 清，泳道2為PPK酶表達后破胞上清。
[0015] 圖4:谷氨酸棒狀桿菌來源的多聚磷酸激酶動力學參數(shù)曲線
[0016] 圖5:嗜熱鏈球菌來源的谷胱甘肽合成雙功能酶以PPK催化生成的ATP為能源酶促 產(chǎn)生谷胱甘肽的反應體系。30禮反應體系中分別添加5111]\1、1〇111]\1、15111]\1、2〇1111、3〇1111八了？時，各 時段的轉(zhuǎn)化率對比。"l〇hGS"為30mM反應體系中只加入了GS酶，僅靠外源添加的ATP提供能 量，反應l〇h后取樣檢測得到的轉(zhuǎn)化率。"22hGS"為30mM反應體系中只加入了GS酶，僅靠外源 添加的ATP提供能量，反應22h后取樣檢測得到的轉(zhuǎn)化率。"10hGS+PPK"為30mM反應體系中 加入了GS酶和PPK酶，靠外源ATP和PPK酶重生的ATP提供能量，并在反應10h后取樣檢測的轉(zhuǎn) 化率。"22hGS+PPK"為30mM反應體系中加入了GS酶和PPK酶，靠外源ATP和PPK酶再生的ATP 提供能量，并在反應22h后取樣檢測的轉(zhuǎn)化率。
[0017] 圖6:酶促反應生成3-磷酸甘油的實驗組和對照組的反應進程對比
[0018] 圖7:酶促反應生成N-乙酰氨基糖胺的實驗組和對照組反應進程對比
【具體實施方式】
[0019] 1.克隆谷氨酸棒狀桿菌中ppk多聚磷酸激酶基因。
[0020] 2.谷氨酸棒狀桿菌中ppk聚磷酸激酶基因重組載體構(gòu)建。
[0021] 3.誘導表達多聚磷酸激酶PPK。將構(gòu)建好的重組表達載體pET28a-ppk質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大 腸桿菌感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)，在IPTG作用下誘導表達。
[0022] 4.超聲破碎表達菌體，提取粗酶液進行反應。合成反應中的酶添加量采用考馬斯 殼監(jiān)測蛋白法進行標定。
[0023] 5.酶法合成ATP。在Tris-HCl緩沖鹽體系和輔因子Mg2+存在下，以ADP為底物，多聚 磷酸鹽為磷酸供體，通過多聚磷酸激酶PPK合成ATP。
[0024] 6.比色法測定NADPIPPK酶反應生成的ATP在己糖激酶作用下與葡萄糖反應生成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖參與6-磷酸葡萄糖脫氫酶的催化反應，使NADP轉(zhuǎn)化成NADPH。 用紫外分光光度計在340nm測NADPH處吸光度，NADPH的摩爾吸系數(shù)為6.22L/(mmol·cm)，根 據(jù)摩爾吸光系數(shù)計算生成的NADPH的量。通過測定NADPH的量間接檢測PPK催化生成的ATP的 量。
[0025] 7.酶法合成谷胱甘肽。在Tris-HCl緩沖鹽體系和輔因子Mg2+存在下，以谷氨酸、甘 氨酸和半胱氨酸為底物，六偏磷酸鹽為磷酸供體，通過嗜熱鏈球菌來源的谷胱甘肽合成雙 功能酶(GS)和谷氨酸棒狀桿菌來源的多聚磷酸激酶(PPK)合成谷胱甘肽。
[0026] 8.谷胱甘肽的檢測。采用四氧嘧啶法測定反應液中GSH的含量，在pH 7.2的緩沖條 件下，反應產(chǎn)物與四氧啼啶結(jié)合，20min后測定結(jié)合物在305nm下的吸光度值。由GSH標準曲 線計算出樣品中GSH的含量。
[0027] 9.酶催化生成3-磷酸甘油。實驗以ADP和甘油為底物，通過PPK酶對ATP的再生為3- 磷酸甘油的產(chǎn)生提供能量，使甘油在甘油激酶的催化作用下生成3-磷酸甘油。用IonPac AS19高容量分離柱和氫氧化鉀梯度洗脫，3-磷酸甘油二鈉的保留時間為16.8min。通過檢測 3_磷酸甘油二鈉的量間接反映PPK酶再生ATP的能力。
[0028] 10.酶催化產(chǎn)生N-乙酰氨基糖胺。在Tris-HCl緩沖體系中加入Mn2+和Mg2+作為輔因 子，首先UDP由PPK酶催化形成UTP，UTP與1-磷酸-a-D葡萄糖為UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的底 物，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶催化生成的UDP葡萄糖再由UDP-葡萄糖4-位差向異構(gòu)酶異構(gòu)化， 然后半乳糖基轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖。用有機酸柱和示差檢測器檢測N-乙酰氨 基葡萄糖的含量，柱溫設定為65度，檢測器溫度為40度，5mM硫酸為流動相，流速為0.5ml/ min，N-乙酰氨基葡萄糖的保留時間為lOmin。實驗通過檢測N-乙酰氨基葡萄糖的量來反映 PPK酶催化NDP生成NTP的能力。
[0029]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明具體方法進一步說明：
[0030] 實施例1
[0031] 1.1谷氨酸棒狀桿菌菌株中ppk聚磷酸激酶基因的克隆與重組載體構(gòu)建
[0032]利用基因組擴增的方法合成谷氨酸棒狀桿菌菌株中ppk聚磷酸激酶基因。以該菌 株全基因組為模板，根據(jù)GenBank序列設計引物，并添加相應的酶切位點(Ncol和EcoRI)與 保護堿基。
[0033] PCR擴增多聚磷酸激酶基因ppk所用引物如下：
[0034]上游引物：5 '-GCATATGATGACCGCCACCGATTC-3'
[0035]下游引物：5 '-GAAGCTTCCGGTTGGTAGCTGTGAC-3'
[0036] PCR體系反應體系含有0.2yL基因組DNA，上下游引物各0.5yL，Extaq混合液10yL， 加雙蒸水補至20yL。反應條件為預變性94°C5min，變性94°C30s，退火55°C30s，延伸72°C lmin，循環(huán)30次，72°C10min，4°C保存。這樣即可克隆擴增到目的多聚磷酸激酶基因ppk，核 酸電泳圖見圖1，顯示1 〇48bp處為ppk基因片段。
[0037] 1.2重組載體質(zhì)粒的構(gòu)建
[0038] 將克隆的PPK基因與pET28a載體(購于Novagen公司）分別用內(nèi)切酶(Ncol和EcoRI) 進行雙酶切，37°C酶切3h，載體與外源基因片段按摩爾比1:3的比例，利用NEB的T4DNA連接 酶16°C連接過夜，用該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，涂布于帶有卡那霉素抗性 LB瓊脂平