一種基于納米金探針結(jié)合基因芯片可視化檢測microRNA的生物傳感器的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物傳感器領(lǐng)域，特別涉及一種基于納米金探針結(jié)合基因芯片可視化 檢測mi croRNA的生物傳感器。
【背景技術(shù)】
[0002]MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約21-25個核苷酸的內(nèi)源性、高保守非編碼小分子RNA，它們主要通過與祀mRNA的3 ' -UTR互補配對來調(diào)芐基因的表達。MiRNAs表達水平的改變 與多種疾病密切相關(guān)，尤其是腫瘤。MiRNAs的檢測對于疾病的早期診斷以及發(fā)現(xiàn)藥物新靶 標(biāo)具有重要作用。然而，由于miRNAs分子序列短小，在體液中豐度較低以及miRNA家族成員 之間的同源性高，使得miRNAs的分析具有挑戰(zhàn)性。Northernblotting是用于miRNAs檢測的 經(jīng)典方法。然而，它具有靈敏度較低、操作繁瑣和耗時的缺點，從而限制了在臨床研究中的 應(yīng)用。實時定量PCR(Real-timePCR，RT-PCR)具有線性范圍寬和靈敏度高的優(yōu)點，但是它需 要精確的溫控條件，并且miRNAs的序列短小使得引物設(shè)計比較復(fù)雜?；陔娀瘜W(xué)的檢測方 法具有很高的靈敏度，但是這種方法很難實現(xiàn)多個miRNAs靶標(biāo)的同時檢測。因此，發(fā)展一種 具有高靈敏、操作簡單并且成本低的miRNAs檢測方法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于納米金探針結(jié)合基因芯片可視化檢 測microRNA的生物傳感器，該生物傳感器對臨床樣本的檢測具有良好適用性，整個分析時 間不超過lh，并且可以用肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果；這種分析方法具有費用低、快速及便捷的優(yōu) 點，有望用于臨床樣本中miRNAs的超靈敏和可視化檢測。
[0004] 本發(fā)明的一種基于納米金探針結(jié)合基因芯片可視化檢測microRNA的生物傳感器， 所述生物傳感器包括：固定在基因芯片上的靶標(biāo)miRNA特異性捕獲探針、miRNA特異性報告 探針和納米金探針以及信號增強液;其中，納米金探針表面的檢測探針序列為：
[0005]SH-TTTTTTTTTTGCACAGGAGCAACAG、SH-TTTTTTTTTTCTGTTGCTCCTGTGC中的一種或兩 種。
[0006] 所述靶標(biāo)miRNA特異性捕獲探針的序列為：
[0007]miR-125a-5p捕獲探針：NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTTCACAGGTTAAA;
[0008]miR-126捕獲探針：NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTCGCATTATTAC。
[0009] 所述靶標(biāo)miRNA特異性報告探針的序列為：
[0010] miR-125a-5p報告探針：GGGTCTCAGGGA(T)i5GTCGTCTGTTGCTCCTGTGC;
[0011]miR-126報告探針：TCACGGTACGA(T)15GTCGTCTGTTGCTCCTGT。
[0012] 采用兩種納米金探針時濃度為0·134nmol/L和6.7nmol/L。
[0013]miRNA特異性報告探針的濃度為lnmol/L。
[0014] 所述信號增強液為25mmol/L的MES緩沖液、30%的H2O2和100mm〇l/L的HA11CI4溶液 按照體積比5:3:2混勻而得。
[0015] 本發(fā)明提供了一種基于納米金探針結(jié)合基因芯片用于miRNA檢測的高靈敏度和便 攜式生物傳感器，如圖1所示。氨基修飾的核苷酸(捕獲探針)通過希夫堿反應(yīng)固定在醛基化 的芯片上，接著，在反應(yīng)體系中加入靶標(biāo)miRNAs、報告探針和納米金探針，它們可以通過堿 基互補配對結(jié)合在芯片上。最后，加入由四氯金酸&61：抑(3111〇1'03111'；[(3(111)3(^(1，撤11(]14)、 過氧化氫（hydrogenperoxide，H2〇2)和2-嗎啉乙橫酸（2-(N-Morpholino)ethanesuIfonic acid，MES)組成的增強反應(yīng)液，H2〇2可以在MES緩沖液中還原HAuCl4為AuQ。增強反應(yīng)的過程 可以視為一個自催化反應(yīng):納米金作為成核位置催化金離子還原成為金原子，還原反應(yīng)的 產(chǎn)物沉積在芯片上，并且反應(yīng)結(jié)果肉眼可見。
[0016] 本發(fā)明利用單個納米金探針結(jié)合基因芯片可以檢測到10pmol/L的革E1標(biāo)miRNAs，測 得miR-126在胎牛血清中的回收率為81.5%-109.1%，并用這種生物傳感器檢測肺癌組織 樣本總RNA中的miR-126,其結(jié)果與定量PCR具有一致性。雙納米金探針的使用進一步提高檢 測靈敏度，可以檢測到lfmol/L的miR-125a_5p。
[0017] 有益效果
[0018] 本發(fā)明對臨床樣本的檢測具有良好適用性，整個分析時間不超過lh，并且可以用 肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果;這種分析方法具有費用低、快速及便捷的優(yōu)點，有望用于臨床樣本中 miRNAs的超靈敏和可視化檢測。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明基于納米金探針結(jié)合基因芯片檢測miRNAs示意圖；
[0020] 圖2為本發(fā)明基于單納米金探針結(jié)合基因芯片檢測miR-125a-5p結(jié)果圖；其中，A為 miR-125a-5p濃度從100nmol/L-10pmol/L的檢測結(jié)果圖及空白對照;B為miR-125a-5p濃度 與灰度值之間的關(guān)系圖；
[0021] 圖3為本發(fā)明基于單納米金探針結(jié)合基因芯片檢測miR-126結(jié)果圖；其中，A為miR-126濃度從100nm〇l/L-10pm〇l/L的檢測結(jié)果圖及空白對照;B為miR-126濃度與灰度值之間 的關(guān)系圖；
[0022]圖4為本發(fā)明基于雙納米金探針結(jié)合基因芯片檢測miR-125a-5p結(jié)果圖；其中，A為miR-125a-5p濃度從100nmol/L-10pmol/L的檢測結(jié)果圖及空白對照;B為miR-125a-5p濃度 與灰度值之間的關(guān)系圖；
[0023]圖5為本發(fā)明基于雙納米金探針結(jié)合基因芯片檢測miR-125a-5p的探針優(yōu)化測試 結(jié)果圖；其中，A為納米金探針2，B為納米金探針1，C為報告探針。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0025] 實施例1 [0026] 1材料與方法
[0027] 1.1試劑和儀器
[0028] 四氯金酸三水合物(HAuCl4· 3H20)購自比利時Acros公司；2-嗎啉乙磺酸(MES)購 自美國Sigma公司；15nm的納米金溶液購自上海水源生物公司；RNA酶抑制劑購自美國ABI公 司.實驗所需核苷酸均在Takara公司合成(表1)。所用試劑均為分析純，實驗用水為去離子 水(電阻率大于18.3ΜΩcnf1)。
[0029] ProSys-5510型芯片點樣儀(美國CartesianTechnology公司）用于將捕獲探針點 到芯片上;JascoV-670型紫外-可見光光譜儀（日本）用于測定紫外-可見吸收光譜;實驗圖 片用連有DP-70數(shù)碼相機和DPcontroller軟件（日本Olympus公司）的BX51型倒置顯微鏡 (日本Olympus公司）拍攝。
[0030]表1實驗中所用序列
[0032] 1.2納米金探針的制備
[0033] 納米金粒子的形態(tài)用透射電子顯微鏡（TransmissionElectronMicroscopy, TEM)進行觀察。用0.2mol/LK2CO3將納米金溶液的pH調(diào)至8.2-8.5dOOOr/min，離心50min， 棄上清，加入檢測探針至其終濃度為3ymol/L，體系總體積為100yL。在4°C靜置16h后，分3次 加入磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffer，ΡΒ;0 ·lmol/L，pH7.2)和NaCl(lmol/L)至其終濃度 分別為0.01m〇l/L和0.1m〇l/L，每次間隔lh。將溶液充分混勻后室溫放置48h，用lml 0.01mol/LPB和0.1mol/LNaCl組成的緩沖液(pH7