一種番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]番前是一種重要的蔬菜作物，近年來(lái)受到番前黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleaf curl virus，TYLCV)病的危害，使我國(guó)番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到了嚴(yán)重的影響。該病害由攜帶番茄黃化葉病毒的煙粉虱進(jìn)行傳播，由于栽培番茄中起初都不含有抗病基因，植株被TYLCV侵染后，生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，易落花落果。如果苗期感病，危害嚴(yán)重時(shí)，甚至造成絕產(chǎn)絕收，對(duì)番茄生產(chǎn)造成了巨大的影響。而在野生番茄中發(fā)現(xiàn)的抗TYLCV基因，經(jīng)過(guò)鑒定發(fā)現(xiàn)，對(duì)該病具有很好的抗性。
[0003]已知的番茄抗TYLCV 基因有，Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty_3a，Ty-4，Ty_5 和 Ty_6。在我國(guó)的番茄品種中應(yīng)用較多的抗病基因是Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-3a。由于TYLCV變異性強(qiáng)，長(zhǎng)期使用現(xiàn)有抗原容易使病毒突破抗病基因的抗性。通過(guò)對(duì)含有ty-5材料1227的引進(jìn)和抗性鑒定，確定該基因?qū)YLCV具有很高的抗性，選育含有ty-5基因的番茄材料，并用于番茄品種中，可以豐富現(xiàn)有品種中抗原的種類(lèi)，增強(qiáng)番茄對(duì)TYLCV的長(zhǎng)久抗性。目前在番茄抗TYLCV育種過(guò)程中，選育含有多個(gè)抗TYLCV基因的品種，可以顯著的增強(qiáng)品種的抗性水平?；谏鲜鲈?，選育同時(shí)含有Ty-2和ty-5的番茄材料具有重要的意義。在對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行聚合育種的過(guò)程中，對(duì)分離群體進(jìn)行抗性鑒定后，所獲得的抗TYLCV植株無(wú)法確定其中含有Ty-2還是ty-5。利用分子標(biāo)記的手段，可以不通過(guò)抗性鑒定，就可以判斷植株中所含的是哪個(gè)抗病基因，加快了對(duì)育種材料的選擇，縮短了育種的進(jìn)程。目前，Ty-2基因被定位在番茄11號(hào)染色體長(zhǎng)臂端，與SCAR標(biāo)記T0302連鎖。ty-5基因被定位在番茄4號(hào)染色體上，與CAPS標(biāo)記S1NAC1連鎖，該標(biāo)記也是目前已知的唯一與ty-5連鎖的分子標(biāo)記。
[0004]雖然利用Ty-2和ty-5的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇可以加快對(duì)含有基因材料的篩選，但是如果可以建立這兩個(gè)基因的多重PCR體系，可以在原來(lái)的基礎(chǔ)上將工作效率提高一倍，鑒定成本減少一半，更加有利于對(duì)抗病基因的篩選。但目前的ty-5基因連鎖標(biāo)記為CAPS標(biāo)記，所用的內(nèi)切酶為T(mén)aqI，在于Ty-2基因的連鎖標(biāo)記構(gòu)建多重PCR體系時(shí)，由于標(biāo)記類(lèi)型和內(nèi)切酶的差異，無(wú)法實(shí)現(xiàn)。至今，仍無(wú)這兩個(gè)基因的多重PCR體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測(cè)方法，用于快速鑒定番茄材料中是否含有番茄黃化曲葉病抗性基因Ty-2和ty-5，有利于對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行聚合育種時(shí)，對(duì)抗病基因材料的篩選。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0007]—種番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測(cè)方法，其包括以下步驟:
[0008]1)從番茄葉中提取待檢測(cè)番茄葉片DNA;
[0009]2)以上述番茄葉片提取獲得的DNA為模板，利用Ty-2和ty-5的引物，通過(guò)建立的多重PCR反應(yīng)體系，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；
[0010]3)PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)；
[0011]4)對(duì)待測(cè)番茄樣品中是否含有Ty-2基因和ty-5基因進(jìn)行鑒定。
[0012]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟1)中的番茄葉取自育種、野生、分離群體番茄品種的番茄葉。
[0013]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟2)中，
[0014]Ty-2 引物為:
[0015]Tyl-F:CAACAGCAATGTACCTGGTCAG
[0016]Tyl-R:CTGTGGCATACGTTGGTGACAC；
[0017]ty-5 引物為:
[0018]ty5-17R:TAACAAAGCCCTCAAAGC
[0019]ty5-17F:GTCTCCGAAACGTAATCCo
[0020]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟2)中，多重PCR反應(yīng)體系為:
[0021 ] lOng/yL模板DNA 2yL,
[0022]4pmmol/L 的引物對(duì) T0302R/F 與 ty5_17R/F 各 0.5yL，
[0023]mix 酶 10yL，
[0024]雙蒸水或三蒸水加至20yL;
[0025]多重PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性3min;每個(gè)循環(huán)95°C變性45sec，54°C退火45sec，72°C延伸45sec，共38個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0026]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟3)中，電泳采用8%的聚丙烯酰胺凝膠，電泳的具體步驟包括:
[0027]a)制備聚丙烯酰胺凝膠:Κ0Η溶液浸泡玻璃板一定時(shí)間，用去污劑和清水清洗干凈，最后用雙蒸水沖洗，晾干后用乙醇擦拭長(zhǎng)短板;然后將長(zhǎng)板處理面向上，短板處理面向下蓋到長(zhǎng)板上，用橡膠條固定兩個(gè)板，插入垂直電泳儀支架，短板向里固定，即凹口板面向電泳液方向，用1 %的瓊脂糖密封橡膠條與玻璃板之間的縫隙；在30%的丙烯酰胺溶液加入10 X TBE、雙蒸水、TEMED以及10 %的APS配置成8 %的聚丙烯酰胺溶液;然后將電泳槽傾斜30度，緩緩地使聚丙烯酰胺溶液倒入兩板間，等膠溶液快要溢出時(shí)，把玻璃板放平，用薄塑料板趕氣泡，倒插梳子;灌完膠后，放于室溫讓其自然凝固，觀察膠邊沿出現(xiàn)折射線就表明膠已凝固；
[0028]b)聚丙烯酰胺凝膠電泳:向電泳儀下端槽內(nèi)倒ΙχΤΒ，向上槽倒1XTBE，使液面高于短板上沿，拔出梳子，并用注射器吸取適量電泳液把點(diǎn)樣孔洗干凈;取PCR產(chǎn)物上樣;調(diào)節(jié)電壓160V，電泳1.5-2.0h，電泳完畢；
[0029]c)聚丙烯酰胺凝膠電泳的顯色:把經(jīng)冷卻的膠板置于盛有固定液的塑料盤(pán)中，搖床震蕩3_8min;然后將膠板置于盛有染色液的塑料盤(pán)中，搖床震蕩10-15min;經(jīng)染色的膠板用雙蒸水清洗，然后用添加了濃度為10 %的Na2S203的雙蒸水清洗;將清洗干凈的膠板置于顯色液中顯色，至DNA條帶清晰后將顯色完畢的膠板放回固定液中反應(yīng)，反應(yīng)完成后用雙蒸水清洗，然后用保鮮膜密封，置于室溫自然干燥，條帶統(tǒng)計(jì)、拍照留存。
[0030]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的固定液由0.5 %乙酸2.5mL、10 %乙醇50mL、雙蒸水450mL組成;所述染色液由硝酸銀與雙蒸水組成，其中硝酸銀與雙蒸水的質(zhì)量比為1:500。[0031 ] 進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的所述顯色液由7.5g Na0H、37%-40%的甲醛1.5mL、雙蒸水500mL組成。
[0032]進(jìn)一步的方案，本發(fā)明所述的步驟4)中，對(duì)待測(cè)樣品中Ty-2基因和ty-5基因進(jìn)行鑒定方法具體步驟為:在步驟3)酶切后的多態(tài)性條帶中大找出750bp和172bp條帶，即分別對(duì)應(yīng)Ty-2基因和ty-5基因。
[0033]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于:
[0034]1本發(fā)明所述的番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測(cè)方法可以用于對(duì)番茄材料和群體中是否含有Ty-2基因和ty-5基因這兩個(gè)基因進(jìn)行快速鑒定，加快了對(duì)分子標(biāo)記輔助選擇的進(jìn)程，縮短了育種周期，降低了育種成本；
[0035]2本發(fā)明所述的番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測(cè)方法克服了對(duì)兩個(gè)基因分離群體進(jìn)行抗性鑒定后無(wú)法確定含有哪個(gè)抗病基因的困擾；
[0036]3.本發(fā)明所述的番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測(cè)方法可降低生產(chǎn)過(guò)程中化學(xué)農(nóng)藥的施用，減輕病害的傳播流行，節(jié)約生產(chǎn)成本，保障番茄生產(chǎn)的順利開(kāi)展，提高番茄產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益；
[0037]4.本發(fā)明所述的番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測(cè)方法效率高，使用成本低，有利于抗病基因材料的篩選。
【附圖說(shuō)明】
[0038]圖1 Ty-2和ty-5檢測(cè)電泳圖譜;其中Μ: lOObp Marker; 1、2、3分別代表T0302以為CLN2777A-0、moneymakei^PFl(CLN2777A-0 Xmoneymaker)模板擴(kuò)增結(jié)果；4、5、6分別代表ty5_17以1227、moneymaker和F1 (1227 Xmone ymaker)為模板擴(kuò)增結(jié)果;7代表多重PCR體系以F1 (1227 X CLN2777A-0)為模板擴(kuò)增結(jié)果；
[0039]圖2 F2( 1227 XCLN2777A-0)分離后代多重PCR檢測(cè)電泳圖譜；其中M:100bp1&^1?^;1-20代表20株隨機(jī)的？2(1227\0^27774-0)分離單株經(jīng)多重?0財(cái)廣增后電泳結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0041 ]一種番茄Ty-2基因和ty-5基因的多重PCR檢測(cè)方法，其包括以下步驟:
[0042]1)提取待檢測(cè)番茄葉片DNA;
[0043]2)以上述番茄葉片提取獲得的DNA為模板，利用Ty_2和ty_5的引物，通過(guò)建立的多重PCR反應(yīng)體系，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；
[0044]其中多重PCR的反應(yīng)體系為:
[0045]lOng/yL模板DNA 2yL,
[0046]4pmmol/L 的引物對(duì)T0302R/F 與 ty5-17R/F各 0.5yL，
[0047]mix 酶 10yL，
[0048]雙蒸水或三蒸水加至20yL;
[0049]PCR反應(yīng)體系中所用引物為:
[0050]T0302R:AGTGTACATCCTTGCCATTGACT[0051 ] T0302F:TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC
[0052]ty5-17R:TAACAAAGCCCTCAAAGC
[0053]ty5-17F:GTCTCCGAAACGTAATCC；
[0054]多重PCR的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性3min ；每個(gè)循環(huán)95°C變性45sec，54°C退火4