一種braf v600e基因的檢測引物組、其構成的反應體系及應用
【技術領域】
[00011本發(fā)明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種BRAFV600E基因的檢測引物組、其 構成的反應體系及應用。
【背景技術】
[0002] BRAF全稱為鼠肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1，是RAF家族的成員之一，定位于人染 色體7q34,是一種原癌基因，其編碼產(chǎn)物是一個94KDa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(B-raf)。 B-raf主要存在于睪丸組織和神經(jīng)組織，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路中重要的轉(zhuǎn)導因子， 參與調(diào)控細胞生長、分化和調(diào)往等重要的細胞事件。B-raf由783個氨基酸殘基組成，其功能 的活化依賴于特點位點的氨基酸殘基的磷酸化，其中位于CR3區(qū)的T598和S601的磷酸化對 于B-raf蛋白的激活至關重要，只有當這兩個位點均磷酸化后，B-raf才能被完全激活。在多 種人類的惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肺癌、甲狀腺癌及肝癌中，均存在不同比 例的81^?突變，其中尤以￥60(^((：.17991'^)突變最為常見，約占所有突變比例的86%。 V600E突變能夠模擬T598和S601兩個位點的磷酸化作用，使B-raf處于持續(xù)活化的狀態(tài)。由 于B-raf是位于K-ras下游級聯(lián)信號通路上的一個重要蛋白，因此當B-raf發(fā)生突變后，其編 碼產(chǎn)物無需接受K-ras的活化信號便處于激活狀態(tài)，使得EGFR抑制劑西妥昔單抗和帕尼單 抗的治療效果減弱甚至無效。同時，一種威羅菲尼已被Π)Α批準用于治療V600E突變陽性的 不可手術的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者。由于腫瘤存在異質(zhì)性，而且取樣標本中往往混入大量的 正常組織，再加上石蠟標本提取的基因組DNA質(zhì)量有限，因此可能會導致檢測結(jié)果可的假陰 性。目前用于檢測BRAF基因突變的方法主要有Sanger測序法、焦磷酸測序法和熒光定量PCR 法，它們的靈敏度依次升高。測序法耗時長，操作繁瑣，靈敏度低，且依賴非常昂貴的進口設 備，不易于大規(guī)模推廣;熒光定量PCR法靈敏度較好，但同樣依賴昂貴的檢測設備和探針，因 此檢測費用一直居高不下，然而患者的檢測又勢在必行，因此亟需我們開發(fā)一種既快速靈 敏又成本低廉的檢測方法。
[0003]環(huán)介導的等溫擴增(LAMP)技術是日本科學家于2000年提出的一種等溫擴增技術， 其主要特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4條特異引物，在鏈置換DNA聚合酶（BstDNA polymerase)的作用下進行恒溫擴增，僅需15-90分鐘即可產(chǎn)生109-101()數(shù)量級的產(chǎn)物。具有 敏感性高、特異性好、操作簡便、成本低廉且結(jié)果易于判定的優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明為了克服上述方法的缺陷，提供一種BRAFV600E基因的檢測引物組、其構 成的反應體系及應用，所述檢測體系具有敏感性高、特異性好和操作簡便等優(yōu)點。
[0005]為達到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術方案：
[0006]第一方面，本發(fā)明提供一種BRAF基因的檢測引物組，其特征在于，所述檢測引物組 如下：
[0007]正向外側(cè)引物F3:SEQIDN0:1;
[0008] 反向外側(cè)引物B3:SEQIDN0:2;
[0009] 正向內(nèi)側(cè)引物FIP:SEQIDN0:3;
[0010]反向內(nèi)側(cè)引物BIP:SEQIDN0:4。
[0011] 所述檢測引物組的核苷酸序列如下：
[0012] 正向外側(cè)引物F3:SEQIDN0:1:TGCTCTGATAGGAAAATGAGA;
[0013]反向外側(cè)引物B3:SEQIDN0:2:GGCCAAAAATTTAATCAGTGG;
[0014]正向內(nèi)偵J弓I物 FIP:SEQIDN 0 : 3 ： CTATGTAGCTAGACCAAAATCACCTGTTTTCCTTTACTTACTACACCT；
[0015] 反向內(nèi)側(cè)引物 BIP:SEQIDN 0 : 4 ： AATCTCGATGGAGTGGGTCCAAAATAGCCTCAATTCTTACCAT〇
[0016]本發(fā)明中，外側(cè)引物記為正向外側(cè)引物F3和反向外側(cè)引物B3，內(nèi)側(cè)引物記為正向 內(nèi)側(cè)引物FIP和反向內(nèi)側(cè)引物BIP，其中FIP包含了Flc和F2，BIP包含了Blc和B2,上述引物均 由在線軟件PrimerExplorerV4設計。本發(fā)明在普通LAMP的基礎上，以特異性要求最嚴格的 Flc的5'端引入特異引物，為進一步加強引物的特異性，通過在Flc的5'端第三位引進額外 突變，進一步降低非特異性擴增的可能性。
[0017] 優(yōu)選地，所述SEQIDN0:3所示的序列是用于檢測BRAFV600E突變的特異性引物。
[0018]第二方面，本發(fā)明提供一種檢測BRAF基因的反應體系，所述反應體系包括權利要 求1或2所述的引物組，反應緩沖液，dNTPs，羥基萘酚藍，甜菜堿，BstDNA聚合酶，待檢樣品 基因組DNA和去離子水。
[0019]優(yōu)選地，所述反應緩沖液包括Tris-HCl，KC1，（NH4)2S〇4，MgS〇4和Tween-20。
[0020]優(yōu)選地，所述Tris-HCl的濃度為 10-30mM，例如可以是 10mM、llmM、12mM、13mM、 15禮、161111、181111、2〇1111、22111]\1、23111]\1、25111]\1、261111、281111或3〇1111，優(yōu)選為15-251111，進一步優(yōu)選為 20mM〇
[0021 ]優(yōu)選地，所述KC1 的濃度為 10-60mM，例如可以是 1OmM、1ImM、12mM、15mM、18mM、 20禮、231111、25111]\1、3〇111]\1、351111、4〇1111、451111、5〇1111、51111]\1、52111]\1、531111、541111、551111或6〇1111，優(yōu)選為 50-55mM，進一步優(yōu)選為50mM。
[0022] 優(yōu)選地，所述(NH4)2S〇4的濃度為 5-13mM，例如可以是 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、1OmM、 1ImM、12mM或13mM，優(yōu)選為8-12mM，進一步優(yōu)選為10mM〇
[0023]優(yōu)選地，所述MgS〇4 的濃度為 2-8mM，例如可以是 2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mMS8mM， 優(yōu)選為2_6mM，進一步優(yōu)選為4mM。
[0024] 優(yōu)選地，所述Tween-20的體積分數(shù)為0 · 1-1 %，例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、 0·4%、0·5%、0·6%、0·7%、0·8%、0·9%或1%，優(yōu)選為0.1%。
[0025] 優(yōu)選地，所述dNTPs的濃度為 1 -2mM，例如可以是ImM、1.ImM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、 1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM或2mM，優(yōu)選為 1.2-1.8mM，進一步優(yōu)選為 1.4mM。
[0026] 優(yōu)選地，所述羥基萘酚藍的濃度為108-130μΜ，例如可以是108μΜ、109μΜ、110μΜ、 111卩]?、1124]\1、1154]\1、1164]\1、1184]\1、12(^]\1、1224]\1、1254]\1、1264]\1、1284]\1或13(^]\1，優(yōu)選為115-123μΜ，進一步優(yōu)選為120μΜ。
[0027] 優(yōu)選地，所述甜菜堿的濃度為0.1-1.21，例如可以是0.謂、0.21、0.4]?、0.61、0.81 或1M，優(yōu)選為0.5-1M，進一步優(yōu)選為1M。
[0028]優(yōu)選地，所述反應體系中每25yL反應體系含有以下組分：
[0031] 去離子水加至25yL。
[0032]第三方面，本發(fā)明提供一種如第二方面所述的反應體系的使用方法，所述方法包 括如下步驟：
[0033]將反應體系所需各組分混合完畢，放置于恒溫水浴鍋進行反應，反應后升溫進行 滅活處理，再根據(jù)體系顏色變化判定結(jié)果。
[0034] 優(yōu)選地，所述恒溫水浴鍋的溫度為55-70°C，例如可以是55°C、56°C、57°C、58°C、59 °(3、60°(3、61°(3、62°(3、63°(3、64°(3、65°(3、68°(3、69°(3或70°(3，優(yōu)選為60-68°(3，進一步優(yōu)選為63 V。
[0035] 優(yōu)選地，所述反應時間為15_90min，例如可以是15min、20min、25min、30min、 35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85mir^90min，tfci￡ 為45_80min，進一步優(yōu)選為60min。
[0036] 優(yōu)選地，所述升溫后的溫度為78-90°C，例如可以是78°C、79°C、80°C、81°C、82°C、 83°(3、84°(3、85°(3、86°(3、87°(3、88°(3、89°(3或90°(3，優(yōu)選為80-85°(3，進一步優(yōu)選為80°(3。
[0037]優(yōu)選地，所述升溫后的反應時間為15_30min，例如可以是15min、16min、17min、 18min、19min、20min、22min、25min、26min、28mir^30mind;i^*18-26min，?-步優(yōu)選為 20min〇
[0038]優(yōu)選地，所述根據(jù)體系顏色變化判定結(jié)果為：
[0039]反應體系為紫羅蘭，則待測樣本不攜帶BRAF V600E突變；
[0040] 反應體系為天藍色，則待測樣本攜帶BRAF V600E突變。
[0041]第四方面，本發(fā)明還提供一種檢測BRAF基因的檢測試劑盒，所述試劑盒包含如第 二方面所述的反應體系。
[0042]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0043] (1)步驟簡單:擴增DNA只需反應體系配置完畢后放置在恒溫水浴鍋中進行反應擴 增即可，不需要預先進行雙鏈DNA的變性及類似于PCR循環(huán)反應中的反復變性、退火、延伸等 變溫過程；
[0044] (2)高特異性:擴增的特異性很高，可以根據(jù)是否擴增就能判斷目標基因的存在與 否，可應用于檢測BRAF突變型等位基因，會給西妥昔單抗和帕尼單抗以及威羅菲尼的正確 使用帶來更可靠的保障；
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