一種dpyd*13基因多態(tài)性的引物及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種DPYD*13基因多態(tài)性的引物及其檢 測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]二氫啼啶脫氫酶（dihydropyrimidinedehydrogenase，DPD)編碼基因是位于 1 號 人類染色體的短臂上（lq22)，基因全長約150kb，含有3kb的編碼序列，其由23個外顯子構(gòu) 成，長度從69bp到1404bp，基因中內(nèi)含子由長短不等的序列組成。二氫嘧啶脫氫酶是作用于 5-FU藥物代謝途徑的關(guān)鍵酶之一，是分解代謝的限速酶，其含量的高低決定了5-FU藥物的 代謝速度，進而影響體內(nèi)藥物的毒性和療效。
[0003]5-Fu及其前體藥物卡培他濱廣泛用于腫瘤化療，80%以上的5-Fu及其前體藥物是 通過DH)代謝降解為無活性代謝物二氫氟尿嘧啶(FUH2)而失活。不同個體間DPD酶活性存在 明顯差別，導(dǎo)致藥物清除率、腫瘤的反應(yīng)性及患者的毒性反應(yīng)存在明顯的個體差異性。
[0004] DPYD突變會影響DPD酶活性的改變，近年來發(fā)現(xiàn)位于外顯子13的C.1679T>G(DPYD *13)突變可能有較大的毒性。因此，檢測DPYD基因多態(tài)性可以對腫瘤患者進行藥物敏感指 導(dǎo)，提高治療效果，降低藥物的毒副作用。
[0005] 中國專利CN102146440B公開了一種甄別DPYD基因*9A突變位點的PCR檢測試劑盒， 所述試劑盒主要包括特異性引物、EvaGreen熒光染料、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物 和DNA聚合酶。該實時熒光PCR檢測方法可以實現(xiàn)二氫嘧啶脫氫酶基因*9A突變位點快速、準 確、特異分析。但是，但其高居不下的假陽性率為實際應(yīng)用所詬病，而且該檢測方法還存在 檢測通量少，每次只能檢測一種突變類型的缺陷，不能滿足實際應(yīng)用的需要。
[0006] 中國專利CN102952866B公開了一種DPYD基因多態(tài)性檢測特異性引物和液相芯片， 該液相芯片包括野生型和突變型ASPE引物，每種ASPE引物由5 '端的tag序列和3 '端針對目 的基因多態(tài)性位點的特異性引物序列組成。該液相芯片可用于并行或單項檢測DPYD基因三 種常見基因型G55A、G141A和G134T的野生型和突變型。但是，上述檢測方法操作復(fù)雜，不利 于大規(guī)模的推廣和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種DPYD* 13基因多態(tài)性的引物及 其檢測方法，該引物主要用于檢測DPYD基因的DPYD*13(c.l679T>G)位點，具有特異性強、檢 測靈敏度高、準確性好等優(yōu)點，為DPYD*13基因多態(tài)性提供了一種簡單有效的檢測方法。
[0008] 本發(fā)明提供了一種0?￥0*13基因多態(tài)性的引物，包括?0財廣增引物和3似?811(^?0? 引物；所述PCR擴增引物為：針對DPYD*13的上游引物5 ' -CAAGCCTGAACTACCCCTCT-3'（SEQ IDN0.1)和下游引物5'-CCTTATCAAGAGAGAAAGTTTTGGT-3'（SEQIDN0.2);所述SNaPshot PCR引物為：針對DPYD*13的SNaPshotPCR引物5 ' -TTTCCATCCAGCTTCAAAAGCTCTTCGA-3 ' (SEQIDN0.3)〇
[0009] 另外，本發(fā)明還提供了一種DPYD*13基因多態(tài)性的檢測方法，包括如下步驟： S1提取DNA樣品； S2以步驟S1提取的DNA樣本為模板，采用權(quán)利要求1中所述的PCR擴增引物進行多重PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行純化； S3以步驟S2純化后的PCR擴增產(chǎn)物為模板，采用權(quán)利要求1中所述的SNaPshotPCR引物 進行SNaPshotPCR擴增，并對SNaPshotPCR擴增產(chǎn)物進行純化； S4采用毛細管電泳技術(shù)進行檢測，對檢測結(jié)果進行分析，確定SNP位點及其基因型。
[0010]進一步地，所述步驟S1中的DNA樣品為EDTA抗凝外周血的DNA樣品。
[0011] 進一步地，所述步驟S2中的多重PCR擴增反應(yīng)條件包括:階段1:98°C3min;階段2: 98°C10s;階段3:58°C30s;階段4:72°Clmin;階段5:返回到階段2,29個循環(huán);階段6:72°C 5min;階段7:25°C保溫。
[0012]進一步地，所述步驟S3中的SNaPshotPCR擴增反應(yīng)條件包括:階段1:96°C10s;階 段2:55°C5s;階段3:60°C30s;階段4:返回到階段1，25個循環(huán);階段5:4°C保溫。
[0013] 進一步地，所述步驟S4中采用GENEMAPPERID V4.1軟件對檢測結(jié)果進行分析。
[00M]除此之外，本發(fā)明提供的所述的DPYD*13基因多態(tài)性的引物在制備檢測DPYD*13基 因多態(tài)性試劑中的用途。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有以下優(yōu)勢:本發(fā)明提供的DPYD*13基 因多態(tài)性的引物具有特異性好，不會發(fā)生交叉反應(yīng)，準確性高的優(yōu)點，實現(xiàn)了DPYD*13基因 多態(tài)性的檢測，可以對腫瘤患者進行有效的藥物敏感指導(dǎo)，提高藥物的清除率、腫瘤的反應(yīng) 性及患者的毒性反應(yīng)，為實現(xiàn)腫瘤患者個體化治療提供了依據(jù)，更有利于腫瘤患者的康復(fù)。
【附圖說明】
[0016 ]圖1為本發(fā)明提供的DPYD* 13基因引物的擴增片段； 圖2為本發(fā)明提供的DPYD* 13基因SNaPshotPCR引物的檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0018]實施例一、引物 本發(fā)明提供的DPYD* 13基因引物如表1所示，包括PCR擴增引物和SNaPshotPCR引物，所 述PCR擴增引物和SNaPshotPCR引物是相對應(yīng)的。本發(fā)明提供的所有引物序列均通過UCSC 數(shù)據(jù)庫比對，無已知SNP位點。
[0019]表1本發(fā)明提供的引物
實施例二、引物的特異性 將本發(fā)明提供的引物于UCSC中進行Blasting，結(jié)果如下： 1)DPYD*13基因特異引物于UCSC中進行Blast，所有引物的擴增片段均覆蓋了相應(yīng)的檢 測位點，無其它同源基因，DPYD*13基因擴增片段位于chrl: 97981281-97981471，長度為 191bp，擴增序列圖如圖1。
[0020] 2)使用表1中SNaPshotPCR引物，SNaPshot法進行檢測，結(jié)果如圖2所示，各產(chǎn)物峰 的相對位置及測序反應(yīng)摻入的堿基與