雌根結(jié)線蟲食道腺基因原位雜交技術(shù)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及雌根結(jié)線蟲基因表達(dá)檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種雌根結(jié)線蟲食道腺基因 原位雜交技術(shù)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)(簡(jiǎn)稱原位雜交Insituhybridization，ISH)是利用帶有 標(biāo)記物的核酸(DNA或RNA)探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)待測(cè)核酸的表達(dá)和分布情況，已知序列的 探針和組織或細(xì)胞內(nèi)的待測(cè)核酸通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，探針上帶有的特定標(biāo)記物，可以 和相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)通過(guò)組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)的方法在待測(cè)核酸的原位形成有色的雜 交信號(hào)；尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，是分析低豐度和罕見的 mRNA表達(dá)的重要技術(shù)，已成為最有效的分子病理學(xué)技術(shù)。
[0003] 根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)可以寄生2000多種植物，給農(nóng)作物生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p 失;根結(jié)線蟲生活史在25約28天;包括卵、一齡幼蟲、二齡幼蟲、三齡幼蟲、四齡幼蟲和和成 蟲階段;其中二齡幼蟲呈線形，雌成蟲膨大呈球形或檸檬形（圖1);雌根結(jié)線蟲蟲體體積最 大，在寄主體內(nèi)存活時(shí)間較長(zhǎng)。
[0004]根結(jié)線蟲在一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)可以繁殖3-4代，每代的繁殖量很大，平均每條雌蟲可產(chǎn) 生300-500個(gè)卵，雌根結(jié)線蟲能夠成功產(chǎn)卵，是造成作物連作基地根結(jié)線蟲蟲口密度不斷上 升的關(guān)鍵因素;但由于雌根結(jié)線蟲在植物體內(nèi)，常規(guī)的防治技術(shù)難對(duì)其進(jìn)行防治;近年來(lái)發(fā) 展起來(lái)的基因沉默技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可望創(chuàng)制出抗根結(jié)線蟲病植物材料。
[0005]運(yùn)用原位雜交技術(shù)對(duì)根結(jié)線蟲中基因表達(dá)部位的研究已經(jīng)有多篇報(bào)導(dǎo)，多種食道 腺分泌蛋白已成功在南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲上進(jìn)行定位;但是所有報(bào)道均是對(duì)呈線狀蟲體 的根結(jié)線蟲二齡幼蟲原位雜交技術(shù)。未見呈球形的雌根結(jié)線蟲原位雜交技術(shù)。
[0006]鑒于雌根結(jié)線蟲在寄主體內(nèi)存活時(shí)間較長(zhǎng)（15-18天），對(duì)其寄主巨型細(xì)胞的調(diào)控 中起到重要作用，因此建立針對(duì)雌根結(jié)線蟲的食道腺基因的原位雜交技術(shù)具有重要的科學(xué) 意義和實(shí)踐意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的首要目的是提供一種雌根結(jié)線蟲食道 腺基因原位雜交技術(shù)。本發(fā)明人通過(guò)查閱已經(jīng)發(fā)表的基因原位雜交文獻(xiàn)，針對(duì)雌根結(jié)線蟲 蟲體易破裂的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并篩選出防止雌根結(jié)線蟲蟲體破裂的系列技術(shù)，從而成功建立了 雌根結(jié)線蟲食道腺基因的原位雜交技術(shù)。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供上述雌根結(jié)線蟲食道腺基因原位雜交技術(shù)的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下方案予以實(shí)現(xiàn)的：一種雌根結(jié)線蟲食道腺基因原位 雜交技術(shù)，包括如下步驟：
[0010] (1)收集活體南方根結(jié)線蟲雌成蟲，4°C2%多聚甲醛溶液浸泡86h，然后22°C4h;
[0011] (2)將浸泡的線蟲去上清，加400yL0.1X固定液重懸浮線蟲，吸置DEPC處理過(guò)的 載玻片，用針灸針把成蟲的前體部扎1-2個(gè)小孔(避免把蟲體弄破），然后將雌根結(jié)線蟲蟲體 收集到滅菌處理后的96孔板中；
[0012] (3)將收集的線蟲用0.1XM9緩沖液漂洗2次，每次lmin;
[0013] ⑷裂解緩沖液22°c處理22min;去上清；
[0014] (5)0.1XM9緩沖液漂洗2次，每次lmin;
[0015] (6)去上清，-78°C的干冰中處理20min;
[0016] (7)-20°C甲醇處理lmin，去上清；
[0017] (8)_20°C丙酮處理lmin，去上清；
[0018] (9)加入20 %的丙酮，22°C水浴20min，去上清；
[0019] (10)預(yù)雜交:加入250yL55°C預(yù)熱的雜交液，45°C輕搖lh;
[0020] (11)探針變性:探針在沸水中變性lOmin，并迅速置于冰水中2 5min，獲得變性的 探針；
[0021 ] (12)將變性的探針加入到250yL55°C預(yù)熱雜交液中，混勻，獲得終濃度為50ngAiL 的混有探針的雜交液；
[0022] (13)將預(yù)雜交后的線蟲去除預(yù)雜交液，加入混有探針的雜交液，避光45°C雜交 18h；
[0023] (14)步驟（13)雜交完成后，倒去雜交液，在45°C、4XSSC緩沖液中洗15min，去上 清，重復(fù)3次；
[0024] (15)線蟲于37°CNTE緩沖液中洗lOmin，去上清；
[0025] (16)加入RNAseA消化未雜交探針，37°C處理lh;
[0026] (17)線蟲于45°C，0.1XSSC緩沖液，0.1 %SDS中洗20min，去上清，重復(fù)3次；
[0027] (18)在22°C馬來(lái)酸緩沖液中浸泡5min去上清；
[0028] (19)加入新鮮配制的0.1X封閉液22°C保溫30min;去上清；
[0029] (20)新鮮配制的0.5mL抗體溶液22°C反應(yīng)2h，去上清；
[0030] (21)在洗滌緩沖液中浸泡15min去上清，重復(fù)3次；
[0031 ] (22)檢測(cè)緩沖液中平衡5min;去上清；
[0032] (23)加入250yL新鮮配制的顯色液試劑，4°C放置暗處，不要?jiǎng)訐u;顯色16h;
[0033] (24)去上清，M9緩沖液漂洗2次，每次lmin，停止顯色，實(shí)現(xiàn)雌根結(jié)線蟲食道腺基因 原位雜交。
[0034]在上述步驟（1)中，為了改進(jìn)雌根結(jié)線蟲內(nèi)部結(jié)構(gòu)固定效果，本發(fā)明對(duì)固定時(shí)間進(jìn) 行了優(yōu)化，固定時(shí)間為：1811，3611，4811，60,8611。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在雌根結(jié)線蟲固定8611時(shí)，固 定效果最好，因此本發(fā)明優(yōu)選86h作為雌根結(jié)線蟲原位雜交的固定時(shí)間。
[0035] 在上述步驟(2)中，由于雌根結(jié)線蟲蟲體較大，容易破裂，本發(fā)明將雌根結(jié)線蟲用 針灸針把成蟲的前體部扎個(gè)小孔(避免把蟲體弄破），然后收集到滅菌處理后的96孔板中； [0036] 步驟(2)中所述的0.1X固定液為0.1XM9緩沖液中加入0.2 % (W/V)的多聚甲醛；
[0037] 步驟(3)中所述的0.1XM9緩沖液由10XM9緩沖液稀釋而成，所述的10XM9緩沖液 的配制方法為：稱取30.24gNa2HP〇4· 12H20,6.0gKH2P〇4，10gNaCl，0.5gMgS〇4.7H20,用 蒸餾水定容至200mL，高壓滅菌。
[0038]步驟(4)中所述的裂解緩沖液為含0.5mg/mL蛋白激酶K的M9緩沖液。
[0039]步驟(10)中所述的雜交液購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
[0040]步驟（11)中所述的探針為根結(jié)線蟲食道腺基因的原位雜交RNA探針;所述的根結(jié) 線蟲食道腺基因的原位雜交RNA探針優(yōu)選為MiPDCD6基因的原位雜交RNA探針；所述的 MiH)⑶6基因的原位雜交RNA探針由引物In-PD-T7F和引物In-PD-R擴(kuò)增獲得;其引物序列如 下：
[0041]In-PD-T7F：TAATACGACTCACTATAGGGGACCAAGACAAATCTGGAAAG；
[0042]In-PD-R：GTTGTAGAAACGGTCAGAAAG〇
[0043]步驟（16)中所述的RNAse A為由ΝΤΕbuffer稀釋成60yg/mL的RNAseA。
[0044] 步驟（18)中所述的馬來(lái)酸緩沖液的配制方法為：稱取11.067g馬來(lái)酸和8.766g NaCl溶于800mL蒸餾水中，用固體NaOH調(diào)pH至7.5，用蒸餾水定容至1L，分裝后高壓滅菌。 [0045]步驟（19)中所述的0.1X封閉液由10X封閉液配制而成，所述的10X封閉液購(gòu)自 廣州聚研生物科技有限公司。
[0046]步驟(20)中所述的抗體溶液的配制方法如下:Anti-Digoxigenin_APlOOOOrpm離 心5min吸取上層0.4yL加入2mL封閉液;所述的Anti-Digoxigenin-AP購(gòu)自廣州聚研生物科 技有限公司。
[0047]步驟（21)中所述的洗滌緩沖液的配制方法如下：馬來(lái)稀酸緩沖液滅菌后加入 0·3%(ν/ν)吐溫 20。
[0048]步驟(22)中所述的檢測(cè)緩沖液的配制方法如下：將1.1688g NaCl溶于100mL蒸餾 水中，加20mL 1M Tris-HCl(pH 8.0)，用NaOH調(diào)pH至9.5,蒸餾水定容至200mL，高壓滅菌，室 溫保存。
[0049]步驟（23)中所述的顯色液的配制方法如下：將NBT/BCIP按1 :50用Detection Buffer稀釋，避光保存；其中NBT(50mg/mL)的配置方法為：100mgNBT加入2mL70%二甲基 甲酰胺溶液溶解;BCIP(50mg/mL)的配置方法為：100mgBCIP加入2mL滅菌水溶解。
[0050]為防止雌根結(jié)線蟲蟲體破裂，在上述步驟(3)、（4)、（5)、（6)、（7)、（8)、（9)、（11)、 (12)、（13)、（14)、（15)、（16)、（17)、（18)、（19)、（20)、（21)、（22)、（24)中均不需要離心，直 接去上清液。
[0051]原位雜交技術(shù)中一個(gè)重要的步驟是對(duì)蟲體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的固定；由于雌根結(jié)線蟲蟲體 較大，用常規(guī)的固定線形線蟲的技術(shù)不能成功固定雌根結(jié)線蟲內(nèi)部結(jié)構(gòu)，因此本發(fā)明就建 立了雌根結(jié)線蟲的固定技術(shù);優(yōu)選的固定技術(shù)參數(shù)如下:將收集的南方根結(jié)線蟲雌成蟲在 2 %多聚甲醛溶液4°C固定86h。
[0052]原位雜交技術(shù)中另一個(gè)重要步驟是把固定好的線蟲切割成2-5段，以方便探針的 進(jìn)入，線狀蟲體切割并不難，但是由于雌根結(jié)線蟲是球形的，切割容易造成蟲體的破裂變 形，本發(fā)明采用針灸針在雌根結(jié)線蟲成蟲的前體部輕輕地扎1-2個(gè)小孔，避免了蟲體的破 裂。
[0053]原位雜交技術(shù)中另一個(gè)重要步驟是反復(fù)沖洗和離心，這樣極易導(dǎo)致雌根結(jié)線蟲蟲 體破裂;本發(fā)明將原位雜交的整個(gè)過(guò)程在滅菌的96孔板中進(jìn)行，沖洗后，不需離心，棄上清 液，試劑的使用量降低為250yL，雜交溫度為45°C。
[0054]經(jīng)過(guò)上述的雌根結(jié)線蟲食道腺基因原位雜交技術(shù)后，顯色后在顯微鏡下觀察發(fā) 現(xiàn)，目的基因在利用反向探針雜交時(shí)，在雌根結(jié)線蟲的食道腺上有明顯的雜交信號(hào)，而正向 探針沒(méi)有雜交信號(hào)。
[0055]上述的雌根結(jié)線蟲食道腺基因原位雜交技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)目的基因在雌根結(jié)線蟲 食道腺中的表達(dá)部位。
[0056]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0057] 1、雌成蟲體積比二齡幼蟲大，改變固定時(shí)間使其固定更徹底，后面的雜交步驟蟲 體不容易破裂；
[0058]2、雌成蟲呈球狀切割容易造成內(nèi)含物流出變形，所以改用針灸針在蟲體扎孔能避 免蟲子變形，而且發(fā)現(xiàn)在蟲體前部扎孔不會(huì)造成蟲體破裂；
[0059]3、改用96孔板實(shí)驗(yàn)可以減少蟲體挪動(dòng)，避免了離心管中因大量蟲子聚集擠壓造成 的變形，而且雌蟲體積較大，較重，不需要離心即能沉到底部，省去離心的步驟，能更好的維 持蟲體不變形；由于96孔板每個(gè)孔的體積限制，試劑用量減少為250yL;
[0060]4、通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新，在南方根結(jié)線蟲雌成蟲食道腺中實(shí)現(xiàn)了基因的原位雜交。
【附圖說(shuō)明】
[0061]圖1南方根結(jié)線蟲雌成蟲MiroCD6基因在食道腺原位雜交效果圖；a:反義探針雜交 結(jié)果;b:正義探針雜交結(jié)果;M:中食道球;G:食道腺。
【具體實(shí)施方式】
[0062]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任 何限定。
[0063] 實(shí)施例1本發(fā)明技術(shù)檢測(cè)Miro⑶6基因在雌根結(jié)線蟲食道腺中的表達(dá)部位；
[0064] 1.試劑購(gòu)買與配置[0065] (1).主要試劑購(gòu)買：
[0066]雜交液:購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；
[0067]Anti-Digoxigenin-AP:購(gòu)自廣州聚研生物科技有限公司；
[0068]10X封閉液(Blocking solution):購(gòu)自廣州聚研生物科技有限公司；
[0069]ScriptMAXTMThermoT7TranscriptionKit:購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限 公司；
[0070