用于處理包含靶細(xì)胞和伴隨細(xì)胞的生物材料樣品以提取靶細(xì)胞的核酸的方法和裝置的制造方法
【專利說(shuō)明】
【背景技術(shù)】
[0001]本發(fā)明涉及用于處理包含靶細(xì)胞和伴隨細(xì)胞的生物材料樣品以提取靶細(xì)胞的核酸的方法和用于處理包含靶細(xì)胞和伴隨細(xì)胞的生物材料樣品以提取靶細(xì)胞的核酸的裝置。本發(fā)明尤其涉及例如用于所謂的芯片實(shí)驗(yàn)室或口袋實(shí)驗(yàn)室(Lab-On-A-Chip)的微流體體系Ο
[0002]在分子診斷中，經(jīng)常需要檢測(cè)樣品中的病原體DNA或RNA。將由病原體，例如病毒或微生物，例如細(xì)菌或真菌獲得的DNA或RNA稱為病原體DNA或RNA。將樣品尤其理解為是指血液樣品，但原則上也可以是指其它液體或液化的患者樣品，例如，尿、糞便、痰、腦脊液、灌洗液(Lavage )、沖洗過(guò)的抹片或液化的組織樣品，特別是當(dāng)它們包含血液或血液痕跡時(shí)。與此相關(guān)的病征例如是尿路感染和敗血癥。在疑似尿路感染的情況中應(yīng)從尿中檢測(cè)病原體。在這種情況下，病原體的濃度可能非常小，例如103至107每毫升。在疑似敗血癥的情況中，例如令人感興趣的是，由血液檢測(cè)病原體以及任選測(cè)定對(duì)某些抗生素的耐受性。由于病原體和白血球之間的濃度比，例如10-1000/ml對(duì)106-107/ml，在這種情況中，在樣品中有很強(qiáng)的人DNA背景。商購(gòu)可得的例如由血液中選擇性提純病原體的方法使用例如化學(xué)試劑，以首先選擇性裂解人細(xì)胞。隨后，酶促消化人核酸。然后例如通過(guò)離心分離和潷析上清液分離病原體。這種方法例如公開(kāi)在DE102005009479A1中。
[0003]US 2010/0285578 A1公開(kāi)了由生物樣品制備核酸的裝置和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]在此背景下，根據(jù)獨(dú)立權(quán)利要求提供用于處理包含靶細(xì)胞和伴隨細(xì)胞的生物材料樣品以提取靶細(xì)胞的核酸的改進(jìn)的方法和用于處理包含靶細(xì)胞和伴隨細(xì)胞的生物材料樣品以提取靶細(xì)胞的核酸的改進(jìn)的裝置。由各自的從屬權(quán)利要求和下文中的描述得到有利的實(shí)施方案。
[0005]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式可以實(shí)現(xiàn)尤其用于由也包含非病原體核酸的樣品例如由血液細(xì)胞選擇性制備病原體核酸的生物樣品的處理，和/或?qū)崿F(xiàn)由樣品積聚病原體并隨后將其裂解。本發(fā)明的實(shí)施方式在這種情況下包括例如用于熱預(yù)處理樣品的方案和/或借助過(guò)濾器以及超聲波用于樣品處理的方案。因此，選擇性裂解伴隨細(xì)胞的熱預(yù)處理與酶促消化和借助過(guò)濾分離的組合尤其具有這樣的目的，即由也包含伴隨細(xì)胞的樣品獲得提純的靶細(xì)胞-核酸。例如也提供借助超聲波在過(guò)濾器上進(jìn)行生物顆粒的裂解，由此可通過(guò)超聲波破壞過(guò)濾器的復(fù)合材料，以及微流體體系。
[0006]具體地，本發(fā)明的實(shí)施方式可有利地用于在分子診斷中例如用于診斷感染性疾病的體系或?qū)嶒?yàn)室例行程序中，或者用于分子診斷中的微流體芯片實(shí)驗(yàn)室體系。
[0007]本發(fā)明的實(shí)施方式可以有利地將含于樣品中的靶細(xì)胞-核酸，例如病原體DNA，從伴隨細(xì)胞-核酸，例如人DNA的背景中可靠地分離出來(lái)。由此避免伴隨細(xì)胞核酸干擾隨后的擴(kuò)增-和檢測(cè)步驟，并因此改善了檢測(cè)和/或診斷的敏感性。在熱預(yù)處理樣品時(shí)可通過(guò)尤其是酶促消化可靠地避免例如在溫度過(guò)高和/或預(yù)處理持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)的樣品膠凝化。在此，樣品的膠凝也可以考慮與膠凝相關(guān)的臨界溫度和持續(xù)時(shí)間取決于樣品的性質(zhì)例如紅細(xì)胞比容來(lái)避免。通過(guò)例如酶促消化可以避免樣品堵塞過(guò)濾器。由此甚至可以處理大的樣品量。在此情況下，過(guò)濾能由相對(duì)大的血液體積，例如1-10毫升，積聚僅少量的病原體，例如10-1000個(gè)。由此，可以提高靶細(xì)胞-核酸的有效濃度并使隨后的擴(kuò)增和檢測(cè)變得容易或者可提高靈敏度。本發(fā)明的實(shí)施方式特別好地適用于自動(dòng)化，特別是在微流體體系中。在這種情況下可容易地施行并且減少污染的風(fēng)險(xiǎn)。
[0008]因此，本發(fā)明的實(shí)施方式能夠?qū)崿F(xiàn)由樣品積聚靶細(xì)胞并由此提高后續(xù)的擴(kuò)增-和/或檢測(cè)步驟的效率。在此也可以以有利的方式尤其利用超聲波來(lái)裂解積聚在過(guò)濾器上的靶細(xì)胞，由此可導(dǎo)致特別有效的分解。與例如離心分離相反，借助過(guò)濾器積聚靶細(xì)胞特別好地適合于自動(dòng)化進(jìn)行，例如在微流體體系中。這樣的自動(dòng)化進(jìn)行的優(yōu)點(diǎn)在于，需要較少的手動(dòng)操作步驟并減少了污染和/或操作者失誤的風(fēng)險(xiǎn)。在將本發(fā)明的實(shí)施方式轉(zhuǎn)移到微流體體系中時(shí)，可在積聚過(guò)程中非常精確地控制流速。由此可避免堵塞過(guò)濾器或者無(wú)意地將靶細(xì)胞通過(guò)過(guò)濾器沖走。
[0009]處理包含靶細(xì)胞和伴隨細(xì)胞的生物材料樣品以提取靶細(xì)胞的核酸的方法具有下列步驟:
通過(guò)從樣品中分離靶細(xì)胞或伴隨細(xì)胞來(lái)積聚樣品的靶細(xì)胞；
通過(guò)化學(xué)和/或物理裂解來(lái)分解靶細(xì)胞，以制備含有靶細(xì)胞-核酸的靶細(xì)胞裂解液;和由靶細(xì)胞-裂解液提純核酸，以提取靶細(xì)胞的核酸。
[0010]所述靶細(xì)胞可包括具有DNA和/或RNA作為核酸的病原體細(xì)胞或病原體，例如病毒或微生物，例如細(xì)菌或真菌。為簡(jiǎn)便起見(jiàn)，在下文中經(jīng)常稱為核酸，在此用其指稱DNA和/或RNA。所述伴隨細(xì)胞可包括人細(xì)胞，例如血液細(xì)胞等?？蓪⒋治龅囊后w稱為樣品，通常為液體的或液化的患者樣品，例如血液、尿、糞便、痰、腦脊液、灌洗液、沖洗過(guò)的抹片或液化的組織樣品。在提純步驟中可提純含于靶細(xì)胞-裂解液中的核酸并供入隨后的分析中，通過(guò)其可驗(yàn)證某種病原體或基因，例如抗性基因的存在。所述隨后的分析例如可通過(guò)測(cè)序、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，實(shí)時(shí)PCR和/或在微陣列上的檢測(cè)或雜交進(jìn)行。
[0011]由樣品提純靶細(xì)胞-核酸可在分解或裂解靶細(xì)胞之后通過(guò)隨后將靶細(xì)胞-核酸吸附在固相例如二氧化硅(Silika)過(guò)濾器或微?；蛩^的微珠上來(lái)進(jìn)行。除了用于裂解的化學(xué)和酶促方法外，還存在機(jī)械方法，例如借助超聲波或微球或微珠。提純的目的是給隨后的擴(kuò)增和/或檢測(cè)提供濃縮形式的靶細(xì)胞-核酸。在分離靶細(xì)胞-核酸與細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)時(shí)也可以有利地使用本發(fā)明的實(shí)施方式。但是，尤其是人血樣品會(huì)額外包含大量的帶有人DNA的伴隨細(xì)胞。分離靶細(xì)胞和伴隨細(xì)胞的一種可能性可能在于，首先選擇性分解或裂解含于樣品中的伴隨細(xì)胞，例如血細(xì)胞并與靶細(xì)胞分離。然后，可將靶細(xì)胞裂解并可提純靶細(xì)胞-核酸。可能靶細(xì)胞僅以很低的濃度存在于樣品中。為在提純前濃縮靶細(xì)胞，也可以例如離心分離樣品或者經(jīng)由過(guò)濾器沖洗樣品。甚至在包含許多伴隨細(xì)胞的樣品的情況中，本發(fā)明的實(shí)施方式也可以將靶細(xì)胞-核酸與樣品中存在的伴隨細(xì)胞-核酸背景分離。否則，伴隨細(xì)胞-核酸將干擾隨后的靶細(xì)胞-核酸的擴(kuò)增和分析，并且可能會(huì)使檢測(cè)靶細(xì)胞的存在變得困難至不可能。因此，可防止伴隨細(xì)胞-核酸在隨后的擴(kuò)增和分析中導(dǎo)致形成不希望的副產(chǎn)物并降低靈敏度。
[0012]根據(jù)一種實(shí)施方式，積聚步驟可具有借助積聚過(guò)濾器將靶細(xì)胞與樣品分離的子步驟。在該分離子步驟中，可借助積聚過(guò)濾器截留靶細(xì)胞。這樣的實(shí)施方式提供了能實(shí)現(xiàn)有效而可靠地選擇靶細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。
[0013]在此，該積聚步驟可具有在分離靶細(xì)胞的子步驟之后的凈化積聚過(guò)濾器的子步驟。為此例如可通過(guò)引導(dǎo)水或水性緩沖液通過(guò)該積聚過(guò)濾器來(lái)洗滌積聚過(guò)濾器。這樣的實(shí)施方式提供了這樣的優(yōu)點(diǎn)，即樣品中的其它成分，例如蛋白質(zhì)被沖洗掉，而靶細(xì)胞以較大純度存在。
[0014]該積聚步驟也可具有將樣品溫度調(diào)節(jié)到用于分解伴隨細(xì)胞的裂解溫度的子步驟和通過(guò)化學(xué)或酶促裂解來(lái)裂解伴隨細(xì)胞并酶促消化由伴隨細(xì)胞釋放的核酸的子步驟。在此，調(diào)節(jié)溫度的子步驟和裂解并消化的子步驟可在分離子步驟之前進(jìn)行。也可適當(dāng)選擇裂解溫度，以使含于樣品中的伴隨細(xì)胞被破壞或預(yù)先破壞，由此完整保留含于樣品中的靶細(xì)胞。這樣的實(shí)施方式提供了能實(shí)現(xiàn)特別有效而可靠地選擇靶細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。在此，由于不同的細(xì)胞壁狀況可有針對(duì)性地使用熱處理。由于裂解，可防止過(guò)濾時(shí)的堵塞。
[0015]在此，裂解和消化子步驟可在調(diào)溫子步驟之前、之中或之后進(jìn)行。由此，可在裂解子步驟中降低樣品的粘度。在這種情況中，尤其可在裂解和消化子步驟中使用耐溫的酶。這樣的實(shí)施方式提供了這樣的優(yōu)點(diǎn)，即由此在熱預(yù)處理期間已經(jīng)可以可靠地避免樣品膠凝。
[0016]此外，在分解步驟中可借助超聲波耦合分解靶細(xì)胞。這樣的實(shí)施方式提供了這樣的優(yōu)點(diǎn)，即由于超聲波引起的壓力波和空化導(dǎo)致靶細(xì)胞的細(xì)胞壁特別可靠而快速地被破壞。
[0017]在分解步驟中可在過(guò)濾器上分解靶細(xì)胞，且過(guò)濾器的復(fù)合材料(Verb