亞家族e猿腺病毒a1302、a1320、a1331和a1337及其用圖
【專利說明】亞家族E猿腺病毒Al 302、A1320、A1331和Al 337及其用途
[0001] 電子形式提交材料的納入?yún)⒖?br>[0002] 本文中以電子形式提交的序列表通過引用納入本文。該文件的文件名為"UPN_ Y6334PCT_ST25 · txt"，創(chuàng)建于2013年5月 17 日，且是3，085，687字節(jié)（2 · 94MB)。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 腺病毒是雙鏈DNA病毒，基因組大小約為36千堿基(kb)，由于能夠在多種靶組織中 實現(xiàn)高效基因轉(zhuǎn)移以及較大的轉(zhuǎn)基因容量，它被廣泛用于基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用。通常，腺病毒的El 基因缺失并被取代為由所選啟動子、感興趣基因 cDNA序列和聚A信號組成的轉(zhuǎn)基因盒，產(chǎn)生 復(fù)制缺陷型重組病毒。
[0005] 腺病毒的形態(tài)特征是由三種主要蛋白和許多群體小蛋白￥1，111、^、111&和1￥ &2 組成的二十面體衣殼，這三種主要蛋白是六鄰體（II)、五鄰體基質(zhì)（III)和突結(jié)纖毛 (knobbed fibre) (IV) [W.C.RussellJ.Gen Virol.，81:2573-3704(2000年11月）]。病毒基 因組為線性雙鏈DNA，末端蛋白共價連接于含有末端反向重復(fù)（ITR)的5 '末端。病毒DNA與高 堿性蛋白VII和小肽pX (先前稱為mu)的密切相連。另一種蛋白V與此DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物包裝 在一起，并通過蛋白VI提供與衣殼的結(jié)構(gòu)連接。該病毒也含有病毒編碼的蛋白酶，這種蛋白 酶是加工某些結(jié)構(gòu)蛋白以產(chǎn)生成熟的感染性病毒所必需的。
[0006]已發(fā)展出針對哺乳動物腺病毒家族的分類方案，所述哺乳動物腺病毒家族包括 人、猿、牛、馬、豬、綿羊、犬和負鼠腺病毒。該分類方案是基于家族中腺病毒序列凝集血紅細 胞能力的差異來發(fā)展的。結(jié)果是6個亞組，目前稱為亞組A、B、C、D、E和F。參見T. Shenk等， Adenoviridae:The Viruses and their Replication〃（腺病毒科：病毒及其復(fù)制），第67 章，F(xiàn)IELD'S VIROLOGY(《費氏病毒學》），第6版，B.N Fields等編（林普科特瑞文出版社 (Lippincott Raven Publishers)，費城，1996)，第111-2112頁。
[0007] 已報道可使用重組腺病毒將異源分子遞送至宿主細胞。參見美國專利6,083,716， 其描述了兩種黑猩猩腺病毒的基因組。猿腺病毒C5、C6和C7描述于美國專利號7,247,472 中，可用作疫苗載體。其他黑猩猩腺病毒描述于WO 2005/1071093,可用于制備腺病毒疫苗 運載體。
[0008] 本領(lǐng)域中需要的載體應(yīng)能將分子有效遞送至靶標并最小化預(yù)存免疫對群體中所 選腺病毒血清型的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了 6種全新的亞家族E猿腺病毒的分離的核酸序列和氨基酸序列，和包 含這些序列的載體。還提供了使用本發(fā)明的載體和細胞的多種方法。這些腺病毒包括^狀-Al302、SAdV-Al320、SAdV-Al331和SAdV-Al337。
[0010] 本文所述方法涉及通過給予本發(fā)明的載體遞送一種或多種所選異源基因至哺乳 動物患者。還提供了用于遞送分子至靶細胞的本文所述腺病毒或重組腺病毒。還提供了本 文所述腺病毒重組腺病毒在制備用于遞送分子至靶細胞的藥物過程中的用途。將本文所述 組合物用于疫苗使得所選抗原得以遞呈，用于誘發(fā)保護性免疫應(yīng)答?；谶@些猿腺病毒的 載體還可用于在體外生產(chǎn)異源基因產(chǎn)物。這類基因產(chǎn)物本身可用于多種目的，如本文所述 的那些。
[0011] 下文中更詳細描述了本發(fā)明的這些和其他實施方式和優(yōu)勢。
[0012] 附圖簡要說明
[0013] 圖1是柱狀圖，反映了注射所示腺病毒載體后第8天和第14天T細胞對HIVgag(短） 的應(yīng)答，所述腺病毒載體攜帶相同轉(zhuǎn)基因。使用免疫顯性HIVgag短CD8 T細胞表位 AMQMLKETKSEQ ID N0:410)，通過IFN-yELISPOT分析T細胞應(yīng)答。
[00M]發(fā)明詳述
[0015] 提供了 來自猿腺病毒 SAd V-A130 2、SAd V-A13 20、SAd V-A13 31 和 SAdV-A 13 3 7 的全新 核酸和氨基酸序列，所有這些序列都分離自黑猩猩糞便。
[0016] 還提供了全新的腺病毒載體和包裝細胞系以生產(chǎn)基于這些序列的載體用于重組 蛋白或片段或其他試劑的體外生產(chǎn)。還提供了用于為治療或疫苗目的遞送異源分子的組合 物。這類治療或疫苗組合物含有攜帶插入的異源分子的腺病毒載體。此外，全新的SAdV序列 可用于提供生產(chǎn)重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體所需的必需輔助功能。因此，提供了這類生產(chǎn)方 法中使用這些序列的輔助構(gòu)建體、方法和細胞系。
[0017] 當術(shù)語"基本同源"或"基本類似"指核酸或其片段時，其表示，在附帶適當核苷酸 插入或缺失與另一核酸(或其互補鏈)進行最佳比對時，比對的序列存在至少約95至99%， 包括約96%、約97%、約98%和約99%的核苷酸序列相同性。
[0018] 當術(shù)語"基本同源"或"基本類似"指氨基酸或其片段時，其表示，在附帶適當氨基 酸插入或缺失與另一氨基酸（或其互補鏈)進行最佳比對時，比對的序列存在至少約95至 99%，包括約96%、約97%、約98%和約99%的氨基酸序列相同性。優(yōu)選在全長序列，或其蛋 白，或其至少8個氨基酸、或更理想至少15個氨基酸長度的片段上具有上述同源性。本文描 述了合適片段的示例。
[0019] 用于指代核酸序列時，術(shù)語"序列相同性百分數(shù)"或"相同性"指以最大對應(yīng)性進行 比對時兩條序列中相同的殘基。在需要使用缺口以將一條序列與另一條進行比對時，相對 于無缺口罰分的較長序列計算評分程度。保持其編碼的多核苷酸或多肽功能的序列較接近 相同。序列相同性比較的長度可涵蓋基因組的全長(如約36kbp)，基因、蛋白、亞基或酶的開 放閱讀框的全長[參見例如提供腺病毒編碼區(qū)的表格]或者至少約500至5000個核苷酸的片 段。然而，也可能要求較小片段之間的相同性，例如至少約9個核苷酸、通常至少約20到24個 核苷酸、至少約28到32個核苷酸、至少約36或更多個核苷酸的片段。類似地，對于蛋白質(zhì)全 長或其片段的氨基酸序列，可容易地確定"序列相同性百分比"。適當?shù)?，片段長度至少為約 8個氨基酸，也可長達約700個氨基酸。本文描述了合適片段的示例。
[0020] 以默認設(shè)置使用本文所定義的算法和計算機程序即可容易地確定相同性。優(yōu)選 地，這類相同性涉及蛋白、酶、亞基的全長，或涉及長度至少約8個氨基酸的片段。然而，相同 性也可基于更短區(qū)域，其適用于應(yīng)用相同基因產(chǎn)物時。
[0021] 如本文所述，用各種從公共渠道獲得或購得的多序列比對程序（Multiple Sequence Alignment Programs)進行比對，例如可通過互聯(lián)網(wǎng)Web服務(wù)器獲得的"Clustal W"進行比對[Thompson等，1994 ,Nucleic Acids Res ,22,4673-4680]?；蛘撸部墒褂?Vector NTI?實用程序[英杰公司（InVitrogen)]。還有許多本領(lǐng)域已知的算法也可用于測 量核苷酸序列相同性，包括上述程序中所包含的那些算法。作為另一示例，可使用GCG 6.1 版中的程序Fasta來比較多核苷酸序列。Fasta可提供查詢序列與檢索序列之間最佳重疊區(qū) 域的比對和序列相同性百分比。例如，可使用GCG 6.1版(通過引用納入本文)提供的Fasta 及默認參數(shù)(字長為6和用于計分矩陣的NOPAM系數(shù))來確定核酸序列之間的序列相同性百 分比。可采用相似程序進行氨基酸比對。雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員可視需要改變設(shè)置，但通常這 些程序都以默認設(shè)置使用?；蛘?，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可采用其他算法或計算機程序，其能夠 得出與參考算法和程序至少同水平的相同性或比對。
[0022] 應(yīng)用于多核苷酸時，"重組"指多核苷酸是克隆、限制性酶切或連接步驟和導(dǎo)致構(gòu) 建體不同于天然存在的多核苷酸的其他步驟的多種組合的產(chǎn)物。重組病毒是包含重組多核 苷酸的病毒顆粒。該術(shù)語分別包括原始多核苷酸構(gòu)建體的復(fù)制體和原始病毒構(gòu)建體的后 代。
[0023] 通常，"異源"表示來源于基因型與用作比較的剩余實體不同的實體。異源核酸序 列指不是分離自、來源于或基于天然產(chǎn)生的腺病毒載體核酸序列的任何核酸序列。"天然產(chǎn) 生"指在自然界中發(fā)現(xiàn)且不是以合成方式制備或修飾的序列。當序列分離自某一來源但經(jīng) 修飾（如通過缺失、取代（突變）、插入或其他修飾)而不破壞源基因的正常功能時，該序列 "來源"于該來源。當序列與來源基本類似時，該序列"基于"該來源。
[0024] 例如，通過遺傳工程技術(shù)導(dǎo)入不同物種來源(且通常是不同的屬、亞科或科）的質(zhì) ?；蜉d體的多核苷酸是異源多核苷酸。從其天然編碼序列上取下并可操作地連接至非天然 連接的編碼序列的啟動子是異源啟動子。已克隆至病毒的基因組或病毒載體中的特定重組 位點（天然狀態(tài)下病毒的基因組不包含該位點）是異源重組位點。異源核酸序列也包括天然 存在于腺病毒基因組中、但位于腺病毒載體中非天然位點的序列。當具有重組酶編碼序列 的多核苷酸用于遺傳改變通常不表達該重組酶的細胞時，對細胞而言，該多核苷酸和重組 酶都是異源的。
[0025] 異源疫苗指以下情形，即導(dǎo)入一種病毒或病毒載體以誘導(dǎo)針對另一物種的病原性 病毒的免疫。在這種情況下，術(shù)語"異源"指來源于具有不同種、屬、亞科或科特異性的病毒 的接種抗原和刺激抗原(challenge antigen)。
[0026] 如本說明書和權(quán)利要求書中所用，術(shù)語"包括"及其變體，包括"包含"、"含有"等， 指包含其它的組分、元素、整數(shù)、步驟等。術(shù)語"由……組成"或"組成為"則不包含其他的組 分、元素、整數(shù)、步驟等。
[0027] I.猿腺病毒序列
[0028] 本發(fā)明提供了猿腺病毒 SAdV-Al 302、SAdV-Al 320、SAdV-Al 331 和 SAdV-Al 337 的核 酸序列和氨基酸序列，各分離自其在自然界中相關(guān)的其他材料。
[0029] A ·核酸序列
[0030] 本文中提供的SAdV-A1302核酸序列包括SEQ ID N0:1的核苷酸1至36430。本文中 提供的SAdV-A1320核酸序列包括SEQ ID NO: 25的核苷酸1至36603。本文中提供的SAdV-A1331核酸序列包括SEQ ID勵:50的核苷酸1至36647。本文中提供的34狀41337核酸序列 包括SEQ ID NO:77的核苷酸1至36639。參見序列表，其通過引用納入本文。
[0031 ]在一個實施方式中，本發(fā)明的核酸序列還包括分別與SEQ ID NO: 1、25、50或77的 序列互補的鏈，以及對應(yīng)于這些序列及其互補鏈的RNA和cDNA序列。在另一個實施方式中， 核酸序列還包括與序列表超過98.5 %相同和優(yōu)選地超過約99 %相同的序列。在一個實施方 式中，還包括SEQ ID NO: 1、25、50或77中提供的序列及其互補鏈的天然變體和經(jīng)工程改造 的修飾。這類修飾包括例如本領(lǐng)域已知的標記、甲基化以及使用簡并核苷酸取代一種或多 種天然產(chǎn)生的核苷酸。




[0037] 在一個實施方式中，提供了SEQ ID NO: 1、25、50或77的序列及其互補鏈、與其互補 的cDNA和RNA的片段，以及與其基本同源的片段。合適的片段長度至少為15個核苷酸，并包 括功能片段，即生物學上感興趣的片段。例如，功能片段可表達所需的腺病毒產(chǎn)物或可用于 生產(chǎn)重組病毒載體。這類片段包括本文表格中列舉的基因序列和片段。表格提供了3六狀-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331和SAdV-A1337序列中的轉(zhuǎn)錄本區(qū)域和開放閱讀框。對于某 些基因，轉(zhuǎn)錄本和開放閱讀框(ORF)位于與SEQ ID NO: 1、25、50或77中所示序列互補的鏈 上。參見例如E2a、E2b和E4。還顯示了經(jīng)計算的所編碼蛋白的分子量。注意Ela開放閱讀框、 E2b開放閱讀框和E4開放閱讀框含有內(nèi)部剪接位點。這些剪接位點見上表。
[0038] SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331 或 SAdV-A1337 腺病毒核酸序列可用作治療 劑和多種載體系統(tǒng)和宿主細胞的構(gòu)建中。如本文中所用，載體包括任何合適的核酸分子，包 括裸DNA、質(zhì)粒、病毒、粘粒或原生質(zhì)體。這些序列和產(chǎn)物可單獨使用或與其他腺病毒序列或 片段聯(lián)用，或與來自其他腺病毒或非腺病毒序列的元件聯(lián)用。SAdV-A1302、SAdV-A1320、 SAdV-A1331或SAdV-A1337序列還可用作反義遞送載體、基因治療載體或疫苗載體。因此，還 提供了含有SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337序列的核酸分子、基因遞送 載體和宿主細胞。
[0039]例如，本發(fā)明包括含有本發(fā)明的猿Ad ITR序列的非天然產(chǎn)生的核酸分子。"非天然 產(chǎn)生"指無法在自然界中找到且已通過重組、遺傳工程或其他技術(shù)進行合成、重排或修飾的 序列或遺傳元件，以及來自含相同物質(zhì)的載體和宿主細胞的后代。在另一個實施例中，本發(fā) 明提供了含編碼所需Ad基因產(chǎn)物的本發(fā)明猿Ad序列的核酸分子。鑒于本文中提供的信息， 使用本發(fā)明的序列構(gòu)建的其他核酸分子對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
[0040]在一個實施方式中，本文中鑒定的猿Ad基因區(qū)域可用于多種載體中，用于將異源 分子遞送至細胞。例如，為表達腺病毒衣殼蛋白（或其片段)制備了載體，用于在包裝宿主細 胞中生成病毒載體的目的?？稍O(shè)計這類載體用于以反式方式表達?；蛘?，設(shè)計這類載體以提 供穩(wěn)定含有表達所需腺病毒功能的序列的細胞，例如一種或多種Ela、Elb、末端重復(fù)序列、 E2a、E2b、E4、E40RF6 區(qū)域。
[0041]此外，腺病毒基因序列及其片段可用于提供輔助依賴性病毒(例如，缺失必要功能 的腺病毒載體，或腺相關(guān)病毒(AAV))的生產(chǎn)所必需的輔助功能。對于這類生產(chǎn)方法，可在這 類方法中以類似于人Ad所述的方式使用SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337序列。然而，由于SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337序列與人Ad序列 之間的差異，SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337序列的使用極大減少或消 除了在攜帶人Ad El功能的宿主細胞(如293細胞）中使用輔助功能進行同源重組的可能性， 其可能在rAAV生產(chǎn)過程中產(chǎn)生感染性腺病毒污染物。
[0042]使用腺病毒輔助功能生產(chǎn)rAAV的方法已詳細描述于人腺病毒血清型的文獻中。參 見例如美國專利6,258,595及其引用的參考文獻。也可參見美國專利5,871，982; WO 99/ 14354;W0 99/15685;W0 99/47691。這些方法還可用于生產(chǎn)非人血清型AAV，包括非人靈長 類△△￥血清型。提供必需輔助功能的54狀-41302、54狀41320、54(^-41331或54(^-41337序 列（如Ela、Elb、E2a、E2b、DNA聚合酶和/或E40RF6)具體可用于提供必需的腺病毒功能，同時 最小化或消除與通常人來源的rAAV包裝細胞中存在的任何其他腺病毒重組的可能性。因 此，所選基因或SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337序列的開放閱讀框可用 于這些rAAV生產(chǎn)方法。
[0043] 或者，重組 SAdV-Al 302、SAdV-Al 320、SAdV-Al 331 或 SAdV-Al 337 載體可用于這些方 法。這類重組腺病毒猿載體可包括例如雜交黑猩猩Ad/AAV，其中黑猩猩Ad序列位于rAAV表 達盒的側(cè)面，所述rAAV表達盒由例如AAV 3'和/或5' ITR和在控制其表達的調(diào)控序列控制下 的轉(zhuǎn)基因組成。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，其他猿腺病毒載體和/或SAdV-Al 302、SAdV-Al 320、 SAdV-A1331或SAdV-A1337基因序列也可用于生產(chǎn)rAAV和其他依賴腺病毒輔助的病毒。
[0044] 在又一個實施方式中，核酸分子被設(shè)計用于在宿主細胞中遞送和表達所選腺病毒 基因產(chǎn)物以實現(xiàn)所需的生理作用。例如，可將包含編碼SAdV-AnOSJAdV-AUSiKSAdV-AlSSl 或 SAdV-A1337Ela 蛋白的序列的核酸分子遞送至對象以用作癌癥治療劑?？蛇x地 ，這 類分子配制在基于脂質(zhì)的運載體中并優(yōu)先靶向癌細胞。這類制劑可與其他癌癥治療劑(如 順鉑、紫杉醇等)混合。本文提供的腺病毒序列的其他用途對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易 見的。
[0045] 此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易地理解，可容易地使SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337序列適用于多種病毒和非病毒載體系統(tǒng)，用于體外、離體或體內(nèi)遞送治 療性和免疫原性分子。例如，SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331 或 SAdV-A1337 猿 Ad 序列 可用于多種rAd和非rAd載體系統(tǒng)。這些載體系統(tǒng)包括例如質(zhì)粒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘病 毒、牛痘病毒和腺相關(guān)病毒系統(tǒng)等。這些載體系統(tǒng)的選擇不是對本發(fā)明的限制。
[0046] 本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)本發(fā)明的猿和猿來源蛋白的分子。這類攜帶多核苷酸 (包括本發(fā)明的猿Ad DNA序列）的分子可以是裸DNA、質(zhì)粒、病毒或任何其他遺傳元件的形 式。
[0047] B · SAdV-Al 302、SAdV-Al 320、SAdV-Al 331 或 SAdV-Al 337腺病毒蛋白
[0048] 提供了本文所述腺病毒核酸所編碼的SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或 SAdV-A1337腺病毒的基因產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、酶及其片段。還包括具有由其他方法制備的這些 核酸序列編碼氨基酸序列的SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337蛋白質(zhì)、酶 及其片段。這類蛋白包括上表中所示開放閱讀框編碼的那些，下表中所示蛋白（參考SEQ ID N0,提供于序列表中），以及與其基本同源的序列。還提供了本文中所示蛋白和多肽的片段， 以及與其基本同源的片段。

[0051 ] *NC =序列表中不可編碼的區(qū)域
[0052]因此，在一個方面，提供了獨特的基本純（即不含其他病毒和蛋白性蛋白）的猿腺 病毒蛋白。優(yōu)選地，這些蛋白至少10%同源，更優(yōu)選60%同源，且最優(yōu)選95%同源。
[0053]在一個實施方式中，提供了獨特的猿來源衣殼蛋白。如本文中所用，猿來源衣殼蛋 白包括含有上文所定義的SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337衣殼蛋白或 其片段的任何腺病毒衣殼蛋白，包括但不限于嵌合衣殼蛋白、融合蛋白、人工衣殼蛋白、合 成衣殼蛋白和重組衣殼蛋白，對制備這些蛋白的方法不作限制。本文所述衣殼可以是完整 的 SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331 或 SAdV-A1337 之一，可以含有 SAdV-A1302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337中超過一種的衣殼蛋白，或者可以含有另一種腺病毒的衣 殼蛋白。
[0054] 合適地，這些猿來源衣殼蛋白含有一種或多種SAdV-Al 302、SAdV-A1320、SAdV-A1331或SAdV-A1337區(qū)域或其片段(例如六鄰體、五鄰體、纖毛或其片段）以及不同腺病毒血 清型的衣殼區(qū)域或其片段，或修飾的猿衣殼蛋白或片段，如本文所述。本文中使用的"趨向 性改變相關(guān)的衣殼蛋白修飾"包括改變的衣殼蛋白，即五鄰體、六鄰體或纖毛蛋白區(qū)域或其 片段，如纖毛區(qū)域的突結(jié)結(jié)構(gòu)域(knob domain)，或編碼相同物質(zhì)的多核苷酸，從而改變特 異性。可使用一種或多種本發(fā)明的猿Ad或者可以是人或非人來源的另一 Ad血清型構(gòu)建猿來 源衣殼。這類Ad可獲自多種來源，包括ATCC、商業(yè)和學術(shù)來源，或者Ad的序列可獲自GenBank 或其他合適來源。
[0055] 提供了SAdV-A1302[SEQ ID N0:5]、SAdV-A1320[SEQ ID N0:29]、SAdV-A1331[SEQ ID N0:54]或SAdV-A1337[SEQ ID N0:81]的五鄰體蛋白的氨基酸序列。合適地，該五鄰體蛋 白或其獨特片段可用于多種目的。合適的片段的示例包括基于上文和SEQ ID N0:5、29、54 或81中提供的氨基酸編碼，在N端和/或C端截去約50、100、150或200個氨基酸的五鄰體。其 他合適的片段包括較短的內(nèi)部、C端或N端片段。此外，可對該五鄰體蛋白進行修飾以用于本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種目的。
[0056] 還提供了SAdV-A1302[SEQ ID N0:9]、SAdV-A1320[SEQ ID N0:34]、SAdV-A1