使用。
[0094] 細胞和病毒：
[0095] 來自美國典型培養(yǎng)物中心（1?0(；1〇^116，]\0)，1]5厶）的￥6仰（厶1'0：0^-81)、冊口-2 (ATCC CCL-23)和P815細胞(ATCC TIB-64)維持在補充有5%熱滅活的胎牛血清（？83; Invitrogen)、100μg/ml鏈霉素和lOOU/ml青霉素的伊格爾最小必需培養(yǎng)基或RPMI (Invitrogen，Milan，意大利）中。輔助細胞系"P-HC"（ "擴增細胞"）來源于表達SeV磷蛋白 (蛋白P)的Vero細胞(Wiegand等人，J. Virol .81:13835-13844,2007)，并且輔助細胞系 "VPN"來源于表達質(zhì)粒編碼的SeV磷蛋白（蛋白P)和核蛋白（蛋白N)的Vero細胞。BSR-T7細胞 ("援救細胞"）（Buchholz 等人，J.Virol.73:251_259,1999)由 Klau s-K. Conze Imann (Munich)友情提供。RSV A型（長鏈，ATCC VR-26)在37°C下在HEp-2細胞上進行培養(yǎng)?；趤?源于仙臺病毒毒株D52(ATCC VR-105)的重組SeV載體的所有疫苗候選物(rdSeV-FRSV/SeV、 rdSeV-FRSV/SeV- Δ CT、rdSeV-sFRSV)均在33°C下進行培養(yǎng)。
[0096] 基因組載體設(shè)計：
[0097] 對于構(gòu)建本發(fā)明的病毒載體，通過重疊 PCR技術(shù)(Horton等人，Gene 77:61-68， 1989)，將含有RSV或SeV F基因的cDNA的質(zhì)粒分別用作構(gòu)建嵌合RSV/SeV F ORF的模板。經(jīng) 由特異性引物設(shè)計，引入含有限制性酶Sail和XhoI的特異性序列的在3'和5'末端處的非重 疊區(qū)。將序列驗證的嵌合ORF插入亞基因組質(zhì)粒構(gòu)建體內(nèi)，所述亞基因組質(zhì)粒構(gòu)建體包含從 野生型基因組的P基因內(nèi)的SanDI限制位點（基因組核苷酸位置2714)直至L基因內(nèi)的SanDI 限制位點（基因組核苷酸位置9131)的仙臺病毒基因組。該基因組片段以F ORF由Sail和 XhoI的限制位點側(cè)接的方式進行修飾。在嵌合F ORF插入中間克隆載體后，rdSeV-FRsv/sev的 全長基因組經(jīng)由來自克隆載體的SanDI片段轉(zhuǎn)移到先前制備的rdSeV的全長構(gòu)建體內(nèi)進行 制備。遵循"六規(guī)則(rule of six)"（Calain等人，J· Virol · 67:4822-4830，1993)，將所得到 的重組SeV基因組指定為"rdSeV-FRSV/ SeV"（編碼嵌合RSV/SeV F蛋白的復(fù)制缺陷型SeV)，并 且通過限制性分析和測序進行驗證。
[0098]通過將來自編碼可溶形式的RSV F蛋白（作為P和M基因之間的另外轉(zhuǎn)基因）的重組 仙臺載體(如通過Voges等人(Voges等人，Cell · Immunol · 247 :85-94，2007)描述的）的亞基 因組EcoRI片段轉(zhuǎn)移到復(fù)制缺陷型仙臺載體(如WO 2006/084746A1中描述的）內(nèi)，來生成表 達可溶性RSV F蛋白的rdSeV-sFRSV載體。遵循"六規(guī)則"（Calain等人，1.￥化〇1.67:4822-4830，1993)，將所得到的重組SeV基因組指定為"rdSeV-sF RSV"（表達RSV可溶性F蛋白的復(fù)制 缺陷型SeV載體），并且通過限制性分析和測序進行驗證。
[0099]病毒援救、繁殖和滴定：
[0100] 如Wiegand等人，J. Virol.81:13835-13844,2007中所述（稍作修改），從經(jīng)轉(zhuǎn)染的 83尺-了7細胞中回收重組病毒<^1^呢6(1?〇(^)以2.(^1/^0嫩用作轉(zhuǎn)染試劑。復(fù)制缺陷型 SeV病毒從上清液中收獲，并且在穩(wěn)定表達SeV P蛋白的輔助細胞系（"P-HC"）中擴增。這種 P-HC系用于所有實驗中，除了與病毒生產(chǎn)效率有關(guān)的實驗（參見圖4)之外，其中疫苗載體 rdSeV-FRSV/SeV在穩(wěn)定表達仙臺病毒P和N蛋白的VPN輔助細胞系(Wiegand等人，J. Virol. 81: 13835-13844,2007)中產(chǎn)生。病毒如先前描述的（Wiegand 等人，1^401.81:13835-13844， 2007)進行滴定，并且滴度作為細胞感染單位/毫升(ciu/ml)(等價于熒光噬斑形成單位)給 出。不同SeV載體的完整性通過RT-PCR和測序進行驗證。
[0101] 蛋白質(zhì)印跡分析：
[0102] 收集來自模擬感染或者用PIV3、RSV或rdPIRV感染的Vero細胞的提取物，并且通過 SDS-PAGE進行分離。在印跡到硝酸纖維素膜上后，用針對PIV3HN和F蛋白的小鼠單克隆抗體 (Chemicon，MiIan，意大利）以及山羊抗RSV抗體(Meridian Life Science，Saco，ME)檢測蛋 白質(zhì)。
[0103] 動物和免疫接種
[0104] 每個實驗重復(fù)至少三次，以確保結(jié)果的重復(fù)性。4-6周齡的雌性BALB/c小鼠購自 Charles River Laboratories(Milan，意大利）。6只小鼠的四組進行鼻內(nèi)或肌內(nèi)免疫接種。 小鼠接受在20μ1體積內(nèi)的1.2x IO6Pfu/劑量的rdSeV-FRSV/SeV、或1.2xl0 7pfu/劑量的rdSeV-FRSV/SeV-sF、或l.Ox l〇W劑量的活RSV或磷酸鹽緩沖液(PBS)。鼻內(nèi)施用分成10μ1/鼻孔。 每組接種三次，即在第O天(初次）、第21天(第一次加強)和第42天(第二次加強)時。在第56 天時，如其它地方描述的（Cusi等人，Vaccine 20:3436-3442，2000)，將小鼠處死用于收集 支氣管肺泡灌洗液（BAL)、鼻洗滌物（NW)、血清和脾細胞。根據(jù)歐洲議會指南（European Parliament directive)2010/63/EU(The European Parliament and the council of the European Union,Directive 2010/63/EU on the protection of animals used for scientific purposes,Official Journal of the European Union 2010(9月22日）， L276:33-79)，所有動物實驗均符合所有相關(guān)機構(gòu)方針。
[0105] ELISA：
[0106 ] IgG和I gA抗體通過酶聯(lián)免疫吸附測定法進行測量。對于病毒特異性IgG和I gA抗體 的測定，如先前描述的（Cusi等人，Vaccine 20:3436-3442,2000)，將滅活的人RSV A型 (Experteam ,Venice，意大利）的純化病毒粒子（lμg/ml)用作抗原。結(jié)果表示為來自三次不 同實驗的兩次測定的平均值±SD。差異通過曼懷二氏秩和檢驗進行測定。
[0107] 中和測定法：
[0108] 病毒中和測定法對于RSV在96孔微板中在Hep-2細胞上進行。簡言之，將免疫接種 的小鼠血清的連續(xù)兩倍稀釋物加入等體積的含有在50μ1中的IOOTCID 5q的RSV中，并且在37 °C下溫育90分鐘，隨后將5χ103細胞加入每個孔中。四天后檢查致細胞病變效應(yīng)(CPE)的存 在?？贵w滴度評估為導(dǎo)致CPE的50%降低的最高稀釋度。測定法執(zhí)行兩次?！?的抗體滴度視 為陰性的。
[0109] 細胞因子和細胞毒性測定法：
[0110]通過Fycol 1-Hypaque(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典）梯度，收集從免疫接種 的小鼠中抽取的脾細胞以及淋巴細胞。在RPMI1640加上10%FCS中的2x IO5未分級細胞在 200μ1的總體積中與10μg/ml純化的滅活病毒或5μg/ml伴刀豆球蛋白A(Sigma，Milan，意大 利)一起培養(yǎng)。對照孔僅接受細胞懸浮液。在培養(yǎng)48小時后，收獲無細胞上清液且分析IFN-y的存在。將樣品IC存于-80°c下。測定法如先前描述的（Cusi等人，Vaccine 20 : 3436-3442,2002)執(zhí)行。
[0111]為了評價細胞毒性，合并來自相同組的每只小鼠的脾細胞（IxlO6細胞/ml)，并且 在RPMI (5 %FCS、100U/ml鏈霉素、100mg/ml青霉素）中培養(yǎng)六天。隨后，使細胞與50單位/ml 重組IL-2(Peprotech，Rocky Hill，NJ/USA)-起在24孔板中溫育兩天，隨后用滅活的PIV3 或RSV(10μg/ml)刺激另外三天。在第5天時，由PIV3或RSV(M0I 5)感染的P815細胞代表的靶 細胞用IOOnCi Na2Cr51〇4(Amersham，Aylesbury，UK)在室溫下標(biāo)記60分鐘。將在 100μ1 完全 培養(yǎng)基中的革巴細胞(〇.5x 104)加入96孔平底測定平板(Corning Costar Corp.，USA)中的 每個孔中。隨后將脾細胞懸浮于IOOyl RPMI培養(yǎng)基（Invitrogen，Milan，意大利）中，并且以 80:1、40:1和20:1的比加入靶細胞中。
[0112]使平板在37°C下溫育6小時，并且收獲上清液用于使用收獲器框架（Skatron Inc.，Sterling，VA/USA)進行γ計數(shù)。未感染的P815靶細胞用作對照，而MHC I類CTL細胞毒 性限制針對P815感染細胞進行測試，并且在執(zhí)行測定法之前，暴露于抗MHC I類mAb(H-2Kd/ H-2Dd) (Pharmingen，Mi Ian，意大利）。測量一式三份完成，并且計算標(biāo)準(zhǔn)差。實驗重復(fù)至少 三次。
[0113]特異性裂解百分比如下計算：100 X [(實驗釋放-自發(fā)釋放)八最大釋放-自發(fā)釋 放）]。由向其中加入?〇〇μ1完全培養(yǎng)基代替效應(yīng)細胞的孔測定自發(fā)釋放。在用2.5% TritonX-IOO處理靶細胞后獲得總的可釋放放射性。
[0114]統(tǒng)計分析
[0115] 正態(tài)分布數(shù)據(jù)，并且使用StatView統(tǒng)計軟件(Abacus Concepts ,Berkeley，加拿 大），通過非參數(shù)曼懷二氏檢驗進行分析?！?.05的概率(P)值視為統(tǒng)計上顯著的。
[0116] 實施例1
[0117] 本發(fā)明的復(fù)制缺陷型SeV載體的生成
[0118] 使用反向遺傳學(xué)技術(shù)，構(gòu)建命名為"rdSeV-FRsv/s，（表達嵌合RSV/SeV F蛋白的復(fù) 制缺陷型SeV載體)的針對人RSV的SeV疫苗載體。除了胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域之外，SeV F ORF替 換為其RSV對應(yīng)物，以獲得嵌合RSV/SeV F表面蛋白（圖1)。另外，為了開發(fā)安全的疫苗載體， SeV主鏈通過刪除N末端76個氨基酸(ΡΔ 2-77)而在磷蛋白（P)基因中進行修飾。如先前所 示，具有缺失P A 2-77的SeV載體不能在非輔助細胞系中合成新的基因組模板，但它仍能夠 初級轉(zhuǎn)錄和基因表達（Bossow等人，Open Virol .J. 6 :73-81，2012) jdSeV-FRsv/sev可以由 cDNA成功援救，并且使用輔助細胞系"P-HC"進行擴增。
[0119] 實施例2
[0120] 復(fù)制缺陷型SeV載體的遺傳穩(wěn)定性
[0121] 在本實施例中，使用被稱為"rdPIRV"（復(fù)制缺陷型PIV3/RSV SeV載體)的特異性復(fù) 制缺陷型SeV構(gòu)建體，評估基因組復(fù)制缺陷型SeV載體的遺傳穩(wěn)定性。盡管該構(gòu)建體不在所 附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，但就穩(wěn)定性而言對于該構(gòu)建體獲得的結(jié)果也視為對于本發(fā)明的基因 組復(fù)制缺陷型SeV載體有效。
[0122] 使用上文描述的和/或本領(lǐng)域已知的技術(shù)，將rdPIRV載體進行遺傳改造，以表達可 溶性RSV F蛋白以及嵌合RSV/SeV F和HN表面蛋白。簡言之，將RSV F胞外域編碼序列作為另 外的轉(zhuǎn)錄單位（表達為可溶性蛋白（sF))插入，如先前所成功采用的（Voges等人， CelI. Immunol. 247: 85-94，2007)。除了胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域之外，SeV F和HN ORF替換為其 PIV3對應(yīng)物。此外，為了開發(fā)安全的疫苗載體，SeV主鏈通過刪除N末端76個氨基酸(ΡΔ 2-77)而在磷蛋白（P)基因中進行修飾。
[0123] rdPIRV可以由cDNA成功援救，并且使用輔助細胞系進行擴增。該載體不能在非輔 助細胞系中合成新的基因組模板，但它仍能夠初級轉(zhuǎn)錄和基因表達，如通過PIV3F和HN以及 RSV sF蛋白質(zhì)表達的蛋白質(zhì)印跡分析證實的（數(shù)據(jù)未顯示）。此外，十次連續(xù)傳代后的序列 分析揭示無突變。
[0124] 這些結(jié)果證實復(fù)制缺陷型SeV/ΡΔ 2-77疫苗載體和從而本發(fā)明的復(fù)制缺陷型SeV 載體的結(jié)構(gòu)完整性和序列穩(wěn)定性。
[0125] 實施例3
[0126] 復(fù)制