一種他達(dá)那非及其結(jié)構(gòu)類似物的人工抗原、抗體及其酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品安全免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種他達(dá)那非及其結(jié)構(gòu) 類似物的人工抗原、抗體及其酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 他達(dá)那非（tadalafil)是繼西地那非的第二代Π )Α批準(zhǔn)使用的用于治療男性功能 性勃起障礙的處方藥，與西地那非一樣均是TOE5抑制劑，相比于西地那非，他達(dá)那非具有藥 效持續(xù)時(shí)間長的優(yōu)點(diǎn)。
[0003] 他達(dá)拉非與西地那非一樣都為非選擇性roE-5,在抑制TOE5的同時(shí)也會(huì)抑制TOE6， 從而引起視覺和聽力的損傷。且若過量服用則會(huì)引起頭痛、消化不良，顏色分辨下降等不良 反應(yīng)，與硝酸酯類藥物的共同服用時(shí)更會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的低血壓，甚至導(dǎo)致心悸猝死，故PDE-5 藥物一定要在醫(yī)生的指導(dǎo)下服用。
[0004] 但近年來發(fā)現(xiàn)，一些保健食品中尤其是天然的補(bǔ)腎壯陽保健品被一些不法商家人 為的添加了TOE-5藥物，若患有糖尿病、高血壓，高血脂、冠心病等疾病的病人在服用硝酸酯 類藥物的同時(shí)又服用這些含有他達(dá)那非類TOE-5藥物的保健品，將會(huì)導(dǎo)致不可預(yù)估的危害， 因此對他達(dá)那非等Η)Ε-5藥物的檢測的研究也尤其迫切和重要。
[0005] 他達(dá)那非的檢測目前最常用的方法為儀器分析法，沈志武等人用反相高效液相色 譜法對膠囊中他達(dá)那非進(jìn)行檢測，檢出限可以達(dá)到5 ng/L，王美玲等人采用高效液相色譜-離子阱飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法檢測保健品中28種磷酸二酯酶-5抑制劑(PDE-5)及其類似物的 含量，該方法的檢出限為0.2~7. Oyg/L。行標(biāo)SN/T 1951-2007中采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜 (LC-MS/MS)方法對出口食品中的他達(dá)那非進(jìn)行檢測。雖然上述幾種儀器分析法的檢測精確 度高，但因其儀器化程度高、檢測時(shí)間長、過程繁瑣、檢測費(fèi)用昂貴等，從而阻礙了其推廣應(yīng) 用，因而通常作為實(shí)驗(yàn)室確證方法，但是無法滿足現(xiàn)場或者大批量的快速篩查檢測。而免疫 分析法因成本低、操作簡單、速度快、一次檢測樣本量大、儀器化程度低，值得我們推廣成為 常用的篩選方法。目前關(guān)于他達(dá)那非的免疫分析方法鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中他達(dá)那非檢測方法出現(xiàn)的上述缺陷， 提供一種他達(dá)那非的人工半抗原。
[0007] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種他達(dá)那非的人工抗原。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供他達(dá)那非的人工抗體。
[0009] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述他達(dá)那非的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0010] 本發(fā)明的的第四個(gè)目的是提供上述試劑盒的使用方法。
[0011] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的： 一種他達(dá)那非半抗原，其結(jié)構(gòu)式為：
[0012] 申請人將氨基他達(dá)那非與多種物質(zhì)結(jié)合，研究其免疫效果，結(jié)果表明當(dāng)和順丁烯 二酸酐相結(jié)合制備半抗原后，利用所述半抗原制備抗原，具有優(yōu)異的免疫效果。
[0013] 本發(fā)明還提供式(I)所述化合物作為檢測他達(dá)那非及其結(jié)構(gòu)類似物的半抗原的應(yīng) 用，其特征在于，式(I)的結(jié)構(gòu)式為：
[0014] 所述他達(dá)那非的結(jié)構(gòu)類似物為正辛基他達(dá)那非、正丁基他達(dá)那非、羥丙基他達(dá)那 非、環(huán)戊基他達(dá)那非、去甲基他達(dá)那非、乙酰他達(dá)那非、氨基他達(dá)那非。
[0015]本發(fā)明所述半抗原的制備方法，是按投料摩爾比為1:1~1.4將氨基他達(dá)那非和順 丁烯二酸酐置于反應(yīng)器中，加入適量的DMF溶解，60~65°C水浴2~4h;將得到的反應(yīng)物60~ 75°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去DMF;得到的殘?jiān)靡宜嵋阴ト芙猓俚渭诱和檫M(jìn)行重結(jié)晶，過濾收集 沉淀即得。
[0016] 氨基他達(dá)那非和順丁烯二酸酐的投料比以及二者的反應(yīng)溫度顯著影響獲得半抗 原的效果，必須要在上述范圍內(nèi)才能獲得效果良好的半抗原。
[0017] 本發(fā)明還提供一種他達(dá)那非人工抗原，由所述他達(dá)那非半抗原與載體蛋白偶聯(lián)獲 得，其結(jié)構(gòu)式為：
其中，Pro為載體蛋白，所述載體蛋白選自牛血清蛋白、人血藍(lán)蛋白或卵清蛋白。
[0018] 本發(fā)明所述的他達(dá)那非人工抗原的制備方法采用活潑酯法，具體步驟如下： (1) 將等摩爾的前述方法制備得到的他達(dá)那非半抗原、DCC、NHS溶解于DMF中，4°C反應(yīng) 過夜； (2) 將步驟（1)所得的反應(yīng)物離心取上清液，將上清液加入到含有載體蛋白（牛血清蛋 白、血藍(lán)蛋白或卵清蛋白）的PBS緩沖液中，將混合物在4°C反應(yīng)12 h; (3) 將步驟(2)中反應(yīng)物裝入到透析袋中，透析得到所述他達(dá)那非人工抗原。
[0019] 本發(fā)明還提供所述他達(dá)那非人工抗原制備得到的他達(dá)那非抗體，包括他達(dá)那非單 克隆抗體、多克隆抗體和基因工程抗體。
[0020] 所述的他達(dá)那非多克隆抗體的制備方法如下:將上述他達(dá)那非人工抗原作免疫原 免疫兔子或小鼠，制備他達(dá)那非多克隆抗體，最后收集抗血清，用辛酸硫酸銨沉淀純化及過 親和層析柱進(jìn)行純化。
[0021 ]所述的他達(dá)那非單克隆抗體的制備方法如下： 為本實(shí)驗(yàn)室前期制備得到，其具體制備方法如下:將上述他達(dá)那非人工抗原作免疫原 免疫兔子或小鼠，用小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，獲得雜交瘤細(xì)胞，將雜交瘤 細(xì)胞置于雌性Balb/c小鼠體內(nèi)培養(yǎng)，獲得含高濃度單克隆抗體的腹水，并對腹水純化得到 高特異性抗他達(dá)那非單克隆抗體。
[0022] 本發(fā)明還提供上述他達(dá)那非半抗原在檢測他達(dá)那非及其結(jié)構(gòu)類似物方面的應(yīng)用； 本發(fā)明還提供上述他達(dá)那非半抗原在制備檢測他達(dá)那非及其結(jié)構(gòu)類似物的制劑方面的應(yīng) 用。
[0023] 本發(fā)明還提供上述他達(dá)那非人工抗原在檢測他達(dá)那非及其結(jié)構(gòu)類似物方面的應(yīng) 用;本發(fā)明還提供上述他達(dá)那非人工抗原在制備檢測他達(dá)那非及其結(jié)構(gòu)類似物的制劑方面 的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明還提供上述他達(dá)那非人工抗體在檢測他達(dá)那非及其結(jié)構(gòu)類似物方面的應(yīng) 用;本發(fā)明還提供上述他達(dá)那非人工抗體在制備檢測他達(dá)那非及其結(jié)構(gòu)類似物的制劑方面 的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明還提供一種他達(dá)那非及其結(jié)構(gòu)類似物酶聯(lián)免疫檢測方法，是利用他達(dá)那非 人工抗原包被酶標(biāo)板。
[0026] 本發(fā)明還提供一種用于檢測他達(dá)那非及其結(jié)構(gòu)類似物的酶聯(lián)免疫分析試劑盒，所 述試劑盒含有上述人工抗原和/或抗體。
[0027] 優(yōu)選地，所述試劑盒包括:包被有他達(dá)那非人工抗原的酶標(biāo)板;他達(dá)那非抗體工作 液;辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗;他達(dá)那非標(biāo)準(zhǔn)品工作液;底物液和底物緩沖液;反應(yīng)終止 液和濃縮洗滌液。
[0028] 其中所述的包被的他達(dá)那非抗原為他達(dá)那非人工合成半抗原與卵清蛋白的偶聯(lián) 物。
[0029] 包被他達(dá)那非抗原的包被液優(yōu)選為按比例將1.69g碳酸鈉和2.95g碳酸氫鈉溶于 1L雙蒸水中得到，他達(dá)那非抗原的包被濃度為31.25 μg/ml;封閉液優(yōu)選為取O.lg BSA(牛 血清白蛋白）、5g甘氨酸、5g蔗糖溶于100mL PBS(0.01mol/L ρΗ7·4)溶液得到。
[0030] 所述包被有他達(dá)那非抗原的酶標(biāo)板是96孔或40孔酶標(biāo)板，材質(zhì)為聚苯乙烯，包被 有能與抗他達(dá)那非抗體特異性結(jié)合的他達(dá)那非抗原，并封閉微孔表面未吸附他達(dá)那非抗原 的位點(diǎn)。
[0031] 另外，可以作為固定他達(dá)那非抗原固相載體的物質(zhì)較多，例如聚苯乙烯、硝酸纖維 素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交聯(lián)葡萄糖、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以為 凹孔、紙片、小珠等。
[0032] 所述的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)鼠二抗或兔二抗，二抗的 工作濃度為1:5000。
[0033] 所述他達(dá)那非標(biāo)準(zhǔn)品工作液的濃度為1 mg/mL;所述他達(dá)那非抗體的工作濃度為 1：8000〇
[0034] 所述的底物液為含有3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)或領(lǐng)苯二胺(0PD)的pH 5.0的 磷酸檸檬酸緩沖液。
[0035] 所述底物緩沖液為含有過氧化氫或過氧化脲的pH 5.0的磷酸檸檬酸緩沖液。
[0036] 所述的反應(yīng)終止液為1-2 mol/L的硫酸溶液或2 mol/L的氫氧化鈉溶液。
[0037] 所述的濃縮洗滌液為含有0.5~1.5%(V/V)吐溫-20的磷酸鹽緩沖液;所述濃縮洗 滌液pH值為7.4.濃縮洗滌液濃度為0.1 mol/L。所述濃縮洗滌液使用時(shí)用去離子水稀釋成1 倍制成洗滌液。
[0038] 本發(fā)明還提供所述試劑盒在檢測他達(dá)那非及其結(jié)構(gòu)類似物方面的應(yīng)用。
[0039]具體地，所述應(yīng)用是利用所述試劑盒檢測他達(dá)那非及其結(jié)構(gòu)類似物，包括如下步 驟： 51. 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于15~35°C平衡30 min~45min; 52. 取出包