6-C)，27.1 (CH3,27-C)，70.6(CH2,28-C)，73.7(CH2,29-C)，19.3(CH3,30-C)，51.1(CH 3,3-0Me);碳原子 標(biāo)記參見(jiàn)圖1。紅外光譜表明該化合物含有羥基（3376CHT 1)，酯基（174201^)，羰基（1708cm -3和烯烴（1624cm-4基團(tuán)。匪R譜表明該化合物含有五個(gè)甲基信號(hào)WH0.87(s，Me-30)， 1.06(s，Me-26)，1.08(s，Me-25)，l.ll(s，Me-27)，1.81(s，Me-23)]，一個(gè)甲氧基[SH3.54(s， 3-016)]，一個(gè)烯屬亞甲基質(zhì)子信號(hào)[6財(cái).85(8，!1-24)，5.06(8，!1-24)]，兩個(gè)含氧亞甲基質(zhì) 子信號(hào)[SH3.08(br，s，2H，H-29)，3.39(d，J= 10.9Hz，H-28)，3.92(d，J=10.9，H-28)]，以及 一個(gè)烯屬次甲基[SH5.41 (t，J = 3.5Hz，H-12) ]。13C NMR譜顯示31個(gè)共振碳信號(hào)，包括六個(gè)甲 基，十二個(gè)亞甲基（一個(gè)烯屬亞甲基，兩個(gè)含氧亞甲基），四個(gè)次甲基（一個(gè)烯屬次甲基），以 及九個(gè)季碳(兩個(gè)羰基，兩個(gè)烯烴季碳）。上述數(shù)據(jù)表明該化合物為3,4_開(kāi)環(huán)-齊墩果烷型三 萜類(lèi)化合物。HMBC 譜中，Μθ-23(δΗ1.81)和 Η2_24(δΗ4.85 和 5.06)與 C-4(SC147.9)和05(δ 〇38.2);]\^-25(3!11.08)與(：-1(3〇35.1)，(：-5(3〇38.2)，(：-9(3〇38.5)和(：-10(3〇41.1) ;!12-1 (3!11.57和2.39)，!12-20!12.1〇和2.52)和3-(1^(5!13.54)與(：-30(：174.8)的相關(guān)性驗(yàn)證了 上述推論，同時(shí)也表明C-3位連有一個(gè)羧甲基。HMBC譜中，Η 2-15(δΗΙ. 64和2.68)，Η2-28(δ Η3.39和3.92)和Η-22(δΗ1.14)與C-16(SC213.1)的相關(guān)性表明C-16為酮羰基。HMBC譜中，羥 基亞甲基質(zhì)子信號(hào)δΗ3·08與甲基碳（δ(：19·3)，C-19(SC43.0)，C-20〇C36.4)和021(δ C30.3)的相關(guān)性，以及N0ESY 譜中 Η-18 (δΗ2.51)與Me-30 (δΗ〇. 87)和Η-12 (δΗ5.41)的相關(guān)性 表明C-29為羥基亞甲基，C-30為甲基。此外，C-28也是羥基亞甲基;HMBC譜中，H2-28 (δΗ3.39 和3.92)與 〇16(3〇213.1)，〇170〇54.2)，(：-18(3〇46.3)和(：-22(3〇25.5)，以及~(^5￥譜中 質(zhì)子信號(hào)δΗ3.47與H-18(δΗ2.51)的相關(guān)性驗(yàn)證了上述推論。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和 N0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類(lèi)型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一 步通過(guò)E⑶試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。
[0026] 實(shí)施例2:化合物（I)藥理作用試驗(yàn)
[0027] 一、材料和儀器
[0028]本實(shí)驗(yàn)采用人腦惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞株，購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心。 DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;氯化鈉、氫氧化鈉、氯化鉀、氯化氧、氫氧化鈉、磷酸 氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、甲醇購(gòu)自南京化工廠?；衔铮↖)自制，HPLC歸一化純度 大于98%。甘氨酸、Tris、Tween20、二甲基亞諷(DMEM)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Aimexin-V/PI細(xì) 胞裯亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；細(xì)胞裂解液、0 · 25%胰蛋白酶、Cell Counting Kit-8試劑盒、青霉素、鏈霉素、Hoechst33258、細(xì)胞核染料DAPI、PMSF、Western blot凝膠配 制試劑盒、細(xì)胞核蛋白提取試劑盒、考馬斯亮藍(lán)染色液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白、5X蛋白質(zhì)變性緩沖液盒、 ECL超敏發(fā)光液、顯影定影試劑盒、X線膠片、硝酸纖維素膜、抗熒光淬滅封片液購(gòu)自江蘇碧 云天生物研宄所。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物科技公司；兔抗人P65抗體購(gòu)自美國(guó)N0VUS 公司；兔抗人Hi stonH3抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；山羊抗兔HRP二抗購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司； 山羊抗兔焚光二抗購(gòu)自美國(guó)EarthOx公司。
[0029] -20°C低溫冰箱(海爾青島），_80°C低溫冰箱(海爾青島），低溫冰箱(海爾青島），高 速離心機(jī)(飛鶴上海），培養(yǎng)皿/板(Coming美國(guó)），離心管(Coming美國(guó)），細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 美國(guó)），倒置顯微鏡(Olympus日本），熒光倒置相差顯微鏡(ZEISS德國(guó)），多用途恒溫水浴箱 (躍進(jìn)上海），電子天平儀(上海機(jī)密科學(xué)儀器），超凈工作臺(tái)（ARITECH日本），微量移液器 (Dragon芬蘭），酶標(biāo)儀(Bio-RAD德國(guó)），流式細(xì)胞儀(BDAccuriC6 [0030]美國(guó)）。
[0031]二、試驗(yàn)方法 [0032] 1、細(xì)胞培養(yǎng)及傳代
[0033]人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1 %青霉素、1 %鏈霉素的 DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37°C，5 %C02培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每隔2天予更換新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞 融合至80%左右后，吸除培養(yǎng)基，并用預(yù)熱的無(wú)菌磷酸酸鹽緩沖液洗3次，然后向培養(yǎng)皿中 加入含0.25%族蛋白酶及0.02%EDTA的細(xì)胞消化液lmL消化約2分鐘，光鏡下觀察細(xì)胞，可 見(jiàn)細(xì)胞逐漸回縮變圓，胞間間隙變寬，此時(shí)移除細(xì)胞消化液，加入完全培養(yǎng)基4mL終止消化， lmL槍頭輕柔吹打制成細(xì)胞懸液，低速離心機(jī)lOOOrpm離心5分鐘，吸除上清液，加入完全培 養(yǎng)基重懸，輕柔吹打均勻后，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)按1:3~1:5傳代，傳代后的細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù) 培，約每周傳代2次，以保持細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法:細(xì)胞計(jì)數(shù)板擦拭干凈，并 將蓋玻片蓋在計(jì)數(shù)板上；將細(xì)胞懸液沿蓋玻片邊緣緩慢滴入計(jì)數(shù)板，光鏡下觀察，細(xì)胞透 明、折光性好為活細(xì)胞，計(jì)數(shù)4個(gè)大方格中的活細(xì)胞數(shù)。每細(xì)胞數(shù)=每個(gè)方格中活細(xì)胞數(shù)平 均值X稀釋倍數(shù)XI 〇4。
[0034] 2、CCK_8檢測(cè)細(xì)胞生存率
[0035] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞，用含EDTA的0.25%胰酶消化吹打細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液 并計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度約2X104個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 yL，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)，吸除原培養(yǎng)基，按分組給予不同處理:空白對(duì)照 組(等量完全培養(yǎng)基），化合物（I)組設(shè)l、2、4mmol/L，每組設(shè)三個(gè)重復(fù)孔，無(wú)菌PBS封閉周邊 各孔，再次置于37°C、5 %⑶滿養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后取出96孔板，吸除各組原 有培養(yǎng)基，更換為l〇〇yL DMEM培養(yǎng)液，本底組無(wú)細(xì)胞只有DMEM培養(yǎng)液。每孔加入10yL CCK-8 溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值(0D值），波長(zhǎng)設(shè)定 在450mn處，取每組復(fù)孔的均值。上述實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)3次，計(jì)算平均值。細(xì)胞生存率計(jì)算公式 如下：細(xì)胞生存率=(實(shí)驗(yàn)組0D值-本底組0D值)/(對(duì)照組0D值-本底組0D值）X 100%，繪制 生長(zhǎng)抑制曲線圖，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0036] 3、Hoechst 33258染色
[0037] 實(shí)驗(yàn)釆用碧云天公司H〇eChst33258染色液，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)看到調(diào)亡細(xì)胞的 細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。根據(jù)細(xì)胞生存率結(jié)果，選取2mmol/L化合物（I)作 用48小時(shí)作為Hoechst 33258染色的條件。將細(xì)胞消化、離心、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度后種入24 孔板中，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)，吸除原有培養(yǎng)基，按分組給予不同處理:空 白對(duì)照組(等量完全培養(yǎng)基），化合物（I)組設(shè)l、2、4mmol/L，無(wú)菌PBS封閉周邊各孔，再次置 于37°C、5 %C02培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后取出24孔板，吸除各組原有培養(yǎng)基，無(wú)菌PBS洗 3次，每孔加入0.5mL多聚甲酸固定細(xì)胞15分鐘，PBS洗3次，各孔加入100yL Hoechst 33258 染色液，室溫黑暗環(huán)境下染色l〇min，去染色液，PBS搖床晃動(dòng)沖洗3次，每次5分鐘，洗盡液 體，每孔滴加一滴抗熒光淬滅液，340nm波長(zhǎng)的熒光顯微鏡下拍照并觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變 化。
[0038] 3、流式