一種制備人凝血因子viii的離子交換層析用洗滌緩沖液及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于血液制品領(lǐng)域，具體涉及一種制備人凝血因子VIII的離子交換層析用 洗滌緩沖液及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 人凝血因子VIII(Human coagulation factorVDI，F(xiàn)Vni)是一種重要的內(nèi)源性凝血 因子，F(xiàn)VIII缺乏會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的遺傳性出血性疾病-甲型血友病。甲型血友病是最常見(jiàn)、發(fā)病率 最高的凝血因子缺陷病，最有效的治療方法就是給患者輸注富含F(xiàn)VIII的血漿制品，達(dá)到預(yù)防 和治療的目的。因此，F(xiàn)VIII是甲型血友病患者的救命藥。
[0003] FVI是以健康人血漿為原料，經(jīng)分離、提純，并經(jīng)病毒去除和滅活處理、凍干制成。 《中國(guó)藥典》2015版規(guī)定，人凝血因子VIII的比活性為每lmg蛋白質(zhì)應(yīng)不低于10.0IU，可見(jiàn)異 物除允許有微量細(xì)小蛋白顆粒外，其余應(yīng)符合規(guī)定。
[0004] 制備FVI常用的方法有沉淀法和層析法，沉淀法包括等電點(diǎn)沉淀，鹽析沉淀，醚沉 淀，酸沉淀和PEG沉淀等，層析法包括離子交換層析，親和層析等。其中，離子交換層析法用 于制備FVIII具有純度較高，重現(xiàn)性好，成本相對(duì)較低的優(yōu)點(diǎn)，為國(guó)內(nèi)外大多數(shù)廠家所采用。
[0005] FVIII分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，易失活，而且由于使用時(shí)需直接注射人體，對(duì)產(chǎn)品的可見(jiàn) 異物要求嚴(yán)格，因此對(duì)FVIII制備工藝的要求較高。采用現(xiàn)有工藝制備FVI時(shí)，對(duì)活性損失較 大，尤其是經(jīng)80°C下，72小時(shí)干熱處理后，活性損失嚴(yán)重；同時(shí)很難保證產(chǎn)品中的可見(jiàn)異物 合格。
[0006] 目前的制備工藝通常是在FVI最終配制時(shí)加入含白蛋白或糖醇或成分復(fù)雜的保護(hù) 劑，以保證產(chǎn)品的較高活性收率和可見(jiàn)異物合格，但是效果不夠理想，而且造成成本升高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種制備人凝血因子VIII的離子交換層析用洗滌緩沖液及制備FVIII 的方法。
[0008] 本發(fā)明提供了一種制備人凝血因子VIII的離子交換層析用洗滌緩沖液，它含有終 濃度為〇. 121-0.129M的氯化鈉。
[0009] M:即mol/L〇
[0010] 進(jìn)一步地，它含有終濃度為0.125M的氯化鈉。
[0011] 其中，所述洗滌緩沖液包括如下配比的組分：
[0012] 氯化鈉 0.121-0.129M，枸櫞酸鈉 0.005-0.015M，氯化鈣0.0005-0.0015M，甘氨酸 0 · 116-0.126M，鹽酸賴氨酸 0· 011-0.021M。
[0013] 進(jìn)一步地，所述洗滌緩沖液包括如下配比的組分：
[0014] 氯化鈉0.125M，枸櫞酸鈉0.01M，氯化鈣0.001M，甘氨酸0.121M，鹽酸賴氨酸 0.016M〇
[0015]其中，所述洗滌緩沖液的pH值為6.5-7.5。
[0016]進(jìn)一步地，所述洗滌緩沖液的pH值為6.95-7.05。
[0017]更進(jìn)一步地，所述洗滌緩沖液的pH值為7.0。
[0018] 本發(fā)明還提供了上述洗滌緩沖液在制備人凝血因子VIII中的用途。
[0019] 本發(fā)明提供了一種制備人凝血因子VIII的聯(lián)合用離子交換層析緩沖液，它包括平 衡緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液；
[0020] 所述洗滌緩沖液為上述洗滌緩沖液；
[0021] 所述平衡緩沖液包括如下配比的組分：氯化鈉0.06-0.16M，枸櫞酸鈉0.005_ 0.015M，氯化鈣0.0005-0.0015M，甘氨酸0.116-0.126M，鹽酸賴氨酸0.011-0.021M;
[0022] 所述洗脫緩沖液包括如下配比的組分：氯化鈉0.25-0.35M，枸櫞酸鈉0.005-0 · 015M，氯化鈣0 · 0005-0 · 0015M，甘氨酸0 · 116-0 · 126M，鹽酸賴氨酸0 · 011-0 · 021M。
[0023] 進(jìn)一步地，所述平衡緩沖液包括如下配比的組分:氯化鈉0.11M，枸櫞酸鈉0.01M， 氯化鈣0.001M，甘氨酸0.121M，鹽酸賴氨酸0.016M;
[0024]所述洗脫緩沖液包括如下配比的組分：氯化鈉0.3M，枸櫞酸鈉0.01M，氯化鈣 0.001M，甘氨酸0.121M，鹽酸賴氨酸0.016M。
[0025]其中，所述平衡緩沖液、洗脫緩沖液的pH值為6.5-7.5。
[0026]進(jìn)一步地，所述平衡緩沖液、洗脫緩沖液的pH值為6.95-7.05。
[0027] 更進(jìn)一步地，所述平衡緩沖液、洗脫緩沖液的pH值為7.0。
[0028] 本發(fā)明還提供了一種制備人凝血因子VIII的方法，它包括如下步驟：
[0029] (1)取血漿，制備冷沉淀，溶解冷沉淀，樣品預(yù)純化，有機(jī)溶劑/去污劑結(jié)合法滅活 病毒，得待上柱樣品；
[0030] (2)離子交換層析：以Toyopearl DEAE 650M凝膠為層析柱填料；
[0031]將步驟（1)得到的待上柱樣品上層析柱，分別使用平衡緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫 緩沖液通過(guò)層析柱，收集得到含人凝血因子珊的洗脫液；
[0032]其中，平衡緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液如上述所示；
[0033] (3)對(duì)步驟(2)得到的洗脫液超濾，凍干、干熱處理，既可。
[0034] 其中，
[0035] 步驟(1)中，所述樣品預(yù)純化采用聚乙二醇沉淀和氫氧化鋁吸附結(jié)合的方式;所述 有機(jī)溶劑/去污劑為聚山梨酯80/磷酸三丁酯，所述滅活病毒的條件為:25 ± 1°C下，6小時(shí)； [0036]步驟(2)中，所有緩沖液的層析流速均為lOOcm/h;
[0037] 步驟(3)中，干熱處理的條件為:80°C下，72小時(shí)。
[0038] 本發(fā)明還提供了上述方法制備得到的人凝血因子VIII。
[0039] 目前常用的離子交換層析用洗滌緩沖液的離子濃度為氯化鈉0.15M。本發(fā)明人在 研究中意外地發(fā)現(xiàn)，洗滌緩沖液的離子強(qiáng)度對(duì)FVIII的活性收率與可見(jiàn)異物影響很大，在洗滌 緩沖液中氯化鈉的終濃度為〇. 121 -0.129M時(shí)，即可以很好的維持FVI的較高活性收率與無(wú) 絮狀物，可見(jiàn)異物合格，而離子強(qiáng)度太低，F(xiàn)VI的雜蛋白增多，容易出現(xiàn)絮狀物;離子強(qiáng)度過(guò) 高，F(xiàn)VIII穩(wěn)定性差，F(xiàn)VIII中間品和成品的活性收率急需下降，蛋白被激活，也容易出現(xiàn)絮狀物。
[0040] 本發(fā)明提供的用于制備人凝血因子VIII的離子交換層析用洗滌緩沖液，通過(guò)控制 氯化鈉的終濃度為0.121-0.129M，能較好的維持FVI制品的質(zhì)量，包括活性、純度和可見(jiàn)異 物。使用本發(fā)明的洗滌緩沖液和純化方法，制備的FVIII中間樣品的活性收率高、純度高，無(wú)絮 狀物出現(xiàn);成品的復(fù)溶性能好，活性收率高、純度高，穩(wěn)定性好，可見(jiàn)異物合格;而且本發(fā)明 的洗滌緩沖液配方簡(jiǎn)單、成本低廉，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
[0041] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0042] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0043]圖1為FVI的制備流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044]下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照試劑盒 說(shuō)明書(shū)選擇。
[0045] 實(shí)驗(yàn)試劑:枸橡酸鈉，氯化媽，氯化鈉，甘氨酸，鹽酸賴氨酸，Toyopearl DEAE 650M 凝膠均為市售品。
[0046] 實(shí)施例1本發(fā)明人凝血因子VIII的制備
[0047] 本發(fā)明人凝血因子VIII的制備流程見(jiàn)圖1。
[0048]制備方法具體如下：
[0049] I、層析前處理
[0050] (1)以新鮮冰凍血漿為原料，經(jīng)血漿融化，離心制備冷沉淀，0.02MTri s緩沖液溶解 冷沉淀，后經(jīng)30 %聚乙二醇沉淀，氫氧化鋁吸附后離心，得上清；
[0051 ] (2)上清經(jīng)過(guò)0.45μπι澄清過(guò)濾后，加入Tween-80 (即聚山梨酯80)和磷酸三丁酯使 其最終濃度分別為1%和0.3%，251±1°〇處理6小時(shí)，完成第一次病毒滅活（8卩30病毒滅 活），得待上柱樣品。
[0052] Π 、離子交換層析 [0053] (1)配制緩沖液
[0054] 平衡緩沖液包括如下配比的組分:0.01M枸櫞酸鈉，0.001M氯化鈣，0.121M甘氨酸， 0 · 016M鹽酸賴氨酸，氯化鈉0 · 11M;調(diào)pH7 · 0;
[0055] 洗滌緩沖液包括如下配比的組分:0.01M枸櫞酸鈉，0.001M氯化鈣，0.121M甘氨酸， 0 · 016M鹽酸賴氨酸，氯化鈉0 · 125M;調(diào)pH7 · 0;
[0056] 洗脫緩沖液包括如下配比的組分:0.01M枸櫞酸鈉，0.001M氯化鈣，0.121M甘氨酸， 0 · 016M鹽酸賴氨酸，氯化鈉0 · 3M;調(diào)pH7 · 0;
[0057] (2)以Toyopearl DEAE 650M為凝膠為層析柱填料;將步驟I得到的待上柱樣品上 層析柱，首先使用7-13倍層析柱體積的平衡緩沖液，層析流速為lOOcm/h;然后使用2-4倍層 析柱體積的洗滌緩沖液，層析流速為l〇〇cm/h;最后使用1-3倍層析柱體積的洗脫緩沖液，層 析流速為l〇〇cm/h;收集得到含人凝血因子珊的洗脫液。
[0058] III、FVIII成品的制備
[0059] (1)超濾：用含枸櫞酸鈉、氯化鈣、鹽酸精氨酸的緩沖液對(duì)步驟Π 獲得的洗脫液進(jìn) 行超濾透析，超濾透析完成后，加入人血白蛋白使其濃度為8g/L;
[0060] (2)再進(jìn)行除菌、分裝、凍干，凍干結(jié)束后，作80°C，72小時(shí)的干熱處理，即得。
[00611 得到的FVIII制品的活性收率為67.5%，比活性為40.5IU/mg;復(fù)溶后外觀澄清，無(wú) 絮狀，可見(jiàn)異物合格，符合藥典規(guī)定。
[0062 ]實(shí)施例2本發(fā)明人凝血因子VIII的制備 [0063]制備方法具體如下：
[0064] I、層析前處理
[0065] 同實(shí)施例1。
[0066] Π 、離子交換層析
[0067] (1)配制緩沖液
[0068] 平衡緩沖液包括如下配比的組分:0.01M枸櫞酸鈉，0.001M氯化鈣，0.121M甘氨酸， 0.016M鹽酸賴氨酸，氯化鈉0.06M;調(diào)pH6.5;
[0069] 洗滌緩沖液包括如下配比的組分:0.01M枸櫞酸鈉，0.001M氯化鈣，0.121M甘氨酸， 0.016M鹽酸賴氨酸，氯化鈉0.121M;調(diào)pH6.5;
[0070] 洗脫緩沖液包括如下配比的組分:0.01M枸櫞酸鈉，0.001M氯化鈣，0.121M甘氨酸， 0.016M鹽酸賴氨酸，氯化鈉0.25M;調(diào)pH6.5;
[0071] (2)以Toyopearl DEAE 650M為凝膠為層析柱填料;將步驟I得到的待上柱樣品上 層析柱，首先使用7-13倍層析柱體積的平衡緩沖液，層析流速為lOOcm/h;然后使用2-4倍層 析柱體積的洗滌緩沖液，層析流速為l〇〇cm/h;最后使用1-3倍層析柱體積的洗脫緩沖液，層 析流速為l〇〇cm/h;收集得到含人凝血因子珊的洗脫液。
[0072] III、FVIII成品的制備 [0073] 同實(shí)施例1。