Ⅱ型單純皰疹病毒突變體在治療癌癥中的用圖
【專利說(shuō)明】Μ型單純皰疹病毒突變體在治療癌癥中的用途
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的參考文獻(xiàn)
[0002] 本申請(qǐng)要求于2005年6月23日提交的臨時(shí)申請(qǐng)第60/693，157號(hào)的優(yōu)先權(quán)，在此通 過(guò)參考的方式將其整體并入。
[0003] 對(duì)于在聯(lián)邦資助的研究或開(kāi)發(fā)下所做出發(fā)明的權(quán)利的聲明
[0004] 本發(fā)明的研發(fā)至少部分地使用了由美國(guó)政府依照ΝΙΗ基金號(hào)R01 CA106671-01提 供的資金。美國(guó)政府可以擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及包括癌癥治療學(xué)在內(nèi)的病毒學(xué)、癌癥生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué) 和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明提供包含I CP 10基因修飾的II型單純皰疹病毒(HSV-2)突變體 以及該HSV-2突變體在治療惡性疾病中的用途。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 作為治療實(shí)體瘤的抗腫瘤試劑，復(fù)制選擇性的溶瘤病毒已顯示出巨大的潛力。這 些病毒能夠偏愛(ài)地在腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，而在正常細(xì)胞中其復(fù)制能力卻受到限制。這種 溶瘤病毒主要的抗腫瘤機(jī)理是通過(guò)當(dāng)其繁殖和從最初感染的腫瘤細(xì)胞向周?chē)[瘤細(xì)胞擴(kuò) 散時(shí)的直接細(xì)胞病變效應(yīng)，以達(dá)到更大限度的分布和抗癌效力。已出于溶瘤目的對(duì)單純皰 疹病毒(HSV)進(jìn)行了修飾，最普遍的是通過(guò)刪除在正常(非分裂的）細(xì)胞而非腫瘤細(xì)胞中復(fù) 制所必須的病毒基因。這種修飾包括刪除病毒γ 34.5基因或ICP6基因。病毒γ 34.5基因在 HSV感染過(guò)程中作為神經(jīng)毒性因子發(fā)揮功能（Chou, et al, (1990)Science 250:1262-1266)。刪除這個(gè)基因阻斷非分裂細(xì)胞中的病毒復(fù)制(Mckie，et al.，（1996)Br J Cancer 74(5) :745-52)。病毒ICP6基因編碼核糖核苷酸還原酶的大亞基，該酶為病毒DNA有效的復(fù) 制產(chǎn)生充足的dNTP池，并且在腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)，但不在非分裂細(xì)胞中大量表達(dá)。于是， 在此基因發(fā)生突變的病毒能夠偏愛(ài)地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并殺死腫瘤細(xì)胞。已經(jīng)在動(dòng)物研究 中進(jìn)行廣泛測(cè)試的溶瘤性HSV G207目前已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，該病毒在γ34.5基因座 的兩個(gè)拷貝中都有缺失且通過(guò)大腸桿菌(E.coliHacZ基因造成了ICP6基因中的插入突變 (Walker，et al.，（1999)Human Gene Ther. 10(13) :2237-2243)?；蛘?，通過(guò)使用腫瘤特異 性啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)γ 34.5或其它批￥復(fù)制所必需的基因能夠構(gòu)建溶瘤性的1型批￥(〇111即，的 al.,(1999)J Virol 73(9):7556-64)〇
[0008] 最初，溶瘤性的單純皰疹病毒(HSV)是為治療腦瘤而設(shè)計(jì)并構(gòu)建的(Andreansky， et al.，（lgge^roc.Natl.AcacL Sci .92(21): 11313-11318)。后來(lái)發(fā)現(xiàn)該病毒在多種其它 人類實(shí)體瘤中也是有效的，包括乳腺癌（Toda，et al.，（1998)Human Gene Ther.9(15): 2177-2185)，前列腺癌（Walker,et al.，（1999)Human Gene Ther. 10(13) :2237-2243)，肺 癌（Toyoizumi，et al.，（1999)Human Gene Ther.10( 18) :3013-3029)，卵巢癌（Coukos，et al.，（1999)Clin.Cancer Res.5(6):1523-1527)，結(jié)腸癌和肝癌（Pawlik，et al. ,(2000) Cancer Res.61(ll): 2790-2795)。溶瘤性 HSVs 的安全性也已在小鼠（Sundaresan，et al ·， (2000) J. Virol. 74(8): 3832-3841)，以及對(duì)HSV感染非常敏感的靈長(zhǎng)類動(dòng)物(夜猴(Aotus)) 中被廣泛測(cè)試(Todo，et al.，（2000)Cancer Gene Ther.7(6):939-946)。這些研究證實(shí)溶 瘤性HSVs對(duì)于體內(nèi)給藥是非常安全的。
[0009] 溶瘤性HSVs全部由HSV-1構(gòu)建而成。尚未研究HSV-2用于構(gòu)建溶瘤性病毒。然而， HSV-2具有某些獨(dú)特的特征增強(qiáng)了其作為溶瘤性試劑的潛力。例如，已報(bào)道與HSV-1不同， HSV-2編碼糖蛋白G(gG)的分泌形式，該蛋白影響嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞核和自然殺傷性 細(xì)胞的功能(Bellner，et al ·，（2005)J Immunol · 174(4): 2235-41)。這種性質(zhì)可能提供衍 生自HSV-2的溶瘤性病毒，而該病毒具有抵制機(jī)體固有免疫的抑制效應(yīng)的能力。固有免疫是 宿主對(duì)于侵入的微生物作出的快速應(yīng)答，并且發(fā)現(xiàn)其為體內(nèi)限制HSV復(fù)制的主要因素 (Dalloul,et al.,(2004)J Clin Virol.30(4):329-36；ffakimoto,et al.,(2003)Gene Ther. 10(11): 983-90)。因此，甚至當(dāng)病人機(jī)體發(fā)展出抗HSV的固有免疫功能時(shí)，衍生自HSV-2的溶瘤性病毒也應(yīng)該復(fù)制并擴(kuò)散。
[0010] 盡管臨床前研究令人鼓舞，但早期臨床試驗(yàn)的結(jié)果顯示當(dāng)前形式的溶瘤病毒雖然 安全，但其自身可能僅具有有限的抗腫瘤活性（Nemunaitis，et al·，（2001)J.Clin Onco 1.19 (2): 289-298)。來(lái)自本發(fā)明人工作的研究已經(jīng)證明將細(xì)胞膜融合活性包括到溶瘤 性HSV中能夠顯著地改善病毒的抗腫瘤能力(Fu，et al.，（2002)Mol.Ther.7(6):748-754; Fu，et al.，（2003)Cancer Res.62:2301-2312)。這種膜融合的溶瘤病毒在腫瘤中產(chǎn)生合胞 體形成，直接增強(qiáng)了病毒的破壞力并促進(jìn)了其腫瘤內(nèi)的擴(kuò)散(Fu，et al.，（2003)Cancer Res. 62:2301-2312)。這種合胞體形成和通過(guò)膜融合的溶瘤HSV直接進(jìn)行細(xì)胞溶解的獨(dú)特的 聯(lián)合腫瘤破壞機(jī)制還促進(jìn)原位腫瘤抗原呈遞，導(dǎo)致有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答(Nakamori， et al .，（2004)Mol .Ther.9(5) :658-665)。此外，通過(guò)形成合胞體的膜融合溶瘤HSV的擴(kuò)散將使 其保持抗腫瘤活性，甚至是在宿主中存在中和抗病毒抗體的情況下。病毒僅能在活細(xì)胞內(nèi) 復(fù)制，且它們的復(fù)制通常需要某些細(xì)胞信號(hào)通路的激活。很多病毒在其進(jìn)化過(guò)程中已經(jīng)獲 得了多種激活這些信號(hào)通路以有益于其復(fù)制的方法。II型單純皰疹病毒(HSV-2)核糖核苷 酸還原酶(ICP10或RR1)的大亞基包含具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PK)活性的獨(dú)特的氨基 末端結(jié)構(gòu)域。已發(fā)現(xiàn)該？1(活性激活細(xì)胞的1^8/1^1(/1^1 31(通路（3111丨認(rèn)，6七31.，（2000)了 Virol.74(22):10417-29)〇
[0011] Luo和Aurelian描述了多種包含HSV-2中ICP10基因不同刪除的載體以證明特定基 序和某些活性之間的關(guān)系（Luo and Aurelian，（1992)J Biol Chem 267(14):9645-53)〇 HSV-2 ICP10基因的修飾和刪除構(gòu)建體已經(jīng)被用于證明核糖核苷酸還原酶結(jié)構(gòu)域的特殊性 質(zhì)（Peng，et al.，（1996)Virology 216(1):184_96)〇
[0012] 從核糖核苷酸還原酶基因中刪除PK結(jié)構(gòu)域(ICP10PK)嚴(yán)重地?fù)p害病毒在沒(méi)有預(yù)先 激活的Ras信號(hào)通路的細(xì)胞中復(fù)制的能力（Smith，et al·，（1998)J Virol.72(ll) :9131-9141)。
[0013] 美國(guó)專利第6013265號(hào)涉及提供針對(duì)HSV-2的保護(hù)的疫苗，其中ICP10的蛋白激酶 結(jié)構(gòu)域被刪除，導(dǎo)致了對(duì)HSV-2感染和轉(zhuǎn)化細(xì)胞能力的有害影響。
[0014] 本發(fā)明通過(guò)提供利用經(jīng)修飾的HSV-2治療癌癥的新治療方法而滿足了本領(lǐng)域的需 要。
[0015]發(fā)明的簡(jiǎn)明概要
[0016]本發(fā)明通過(guò)提供有效的經(jīng)修飾的具有溶瘤特性的II型單純皰疹病毒(HSV-2)滿足 了本領(lǐng)域的長(zhǎng)期需求。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，病毒含有經(jīng)修飾的、編碼具有核糖核 苷酸還原酶活性但缺乏蛋白激酶活性的ICP10多肽的ICP10多聚核苷酸。在特定方面，該病 毒用于治療惡性細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，病毒選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。在其它具體實(shí) 施方案中，病毒產(chǎn)生細(xì)胞膜融合，使培養(yǎng)物、組織或生物體擺脫至少一些不期望的細(xì)胞。在 其它具體實(shí)施方案中，病毒至少抑制一些不期望細(xì)胞的增殖，和/或在至少一些期望的細(xì)胞 中誘導(dǎo)凋亡，和/或誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫應(yīng)答，和/或其組合。
[0017] 天然HSV-2病毒含有ICP10多聚核苷酸(也可稱為RR1多聚核苷酸），該多聚核苷酸 編碼具有氨基末端結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域的多肽，該氨基末端結(jié)構(gòu)域具有蛋白激酶(PK)活 性，如絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，該C末端結(jié)構(gòu)域具有核糖核苷酸還原酶活性。在本發(fā)明的特 定方面，內(nèi)源性PK結(jié)構(gòu)域經(jīng)修飾，使病毒具有在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制的活性(因此包含破 壞腫瘤細(xì)胞的活性），和/或賦予病毒膜融合活性或增強(qiáng)病毒的融合活性，由于其包含膜融 合(合胞體形成)活性。在一些實(shí)施方案中，ICP10多聚核苷酸通過(guò)至少刪除編碼蛋白激酶結(jié) 構(gòu)域的部分內(nèi)源性序列而被修飾，以使被編碼的多肽缺乏蛋白激酶活性。
[0018] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，第二多聚核苷酸取代至少部分編碼至少部分蛋白 激酶結(jié)構(gòu)域的內(nèi)源性ICP10多聚核苷酸。在本發(fā)明其它實(shí)施方案中，未被取代的ICP10序列 包含整個(gè)RR結(jié)構(gòu)域。對(duì)至少部分內(nèi)源性ICP10多聚核苷酸的取代可通過(guò)任意適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn) 行，如通過(guò)同源重組或其它適當(dāng)?shù)幕蚬こ谭椒?，包括使用PCR和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其 它方法。
[0019] 在本發(fā)明的其它方面中，取代ICP10的至少部分內(nèi)源性PK結(jié)構(gòu)域的多核苷酸可以 是任何適當(dāng)?shù)男蛄?。例如，取代PK結(jié)構(gòu)域的多聚核苷酸可以編碼報(bào)告基因產(chǎn)物或治療性基 因產(chǎn)物。經(jīng)修飾的包含第二多聚核苷酸(至少取代PK結(jié)構(gòu)域中的一部分）的ICP10多聚核苷 酸將編碼由取代多聚核苷酸和ICP10基因中剩余的未取代部分組成的融合蛋白。適合本發(fā) 明使用的報(bào)告基因的非限制性實(shí)例包括綠色熒光蛋白（SEQ ID N0:16;GeneBank登錄號(hào) U55761)，i3-半乳糖苷酶，熒光素酶和單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)。治療性多聚核苷酸 的非限制性實(shí)例可以包括單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)，胞嘧啶脫氨酶，半胱天冬酶 (088口&86)3和野生型卩53。
[0020] 在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，取代至少部分ICP10內(nèi)源性PK結(jié)構(gòu)域的多聚核苷酸 可以是免疫調(diào)芐基因，或編碼融合性膜糖蛋白（FMG)的多聚核苷酸。適合本發(fā)明使用的免疫 調(diào)芐基因的非限制性實(shí)例包括IL2、IL12或GM-CSF和其它細(xì)胞因子;F42K和其它細(xì)胞因子類 似物;或MIP-l、MIP-li3、MCP-l、RANTES和其它趨化因子。適合本發(fā)明使用的編碼融合性膜糖 蛋白的多聚核苷酸的非限制性實(shí)例包括副粘病毒F蛋白、HIV gpl60蛋白、SIV gpl60蛋白、 逆轉(zhuǎn)錄病毒Env蛋白、埃博拉病毒Gp或流感病毒血凝素，來(lái)自長(zhǎng)臂猿白血病病毒(GALV)的膜 糖蛋白或長(zhǎng)臂猿白血病病毒包膜糖蛋白（GALV. fus)的C末端截短形式。
[0021] 在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的ICP10多聚核苷酸與組成型啟動(dòng)子可操作 地連接。適合本發(fā)明使用的組成型啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括即早期巨細(xì)胞病毒(CMV)啟 動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、RSV LTR、β雞肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和HSV0-TK啟動(dòng)子。在本發(fā)明的其它實(shí) 施方案中，取代至少部分內(nèi)源性ΡΚ結(jié)構(gòu)域(或ΤΜ結(jié)構(gòu)域)的多聚核苷酸包含與其可操作地連 接的調(diào)節(jié)序列。在具體實(shí)施方案中該調(diào)節(jié)序列在真核細(xì)胞中可操作，在其它方面中在癌細(xì) 胞中是可操作的。用于實(shí)施本文所述的方法和組合物的非限制性示例性啟動(dòng)子可以包括腫 瘤特異性啟動(dòng)子和/或組織特異性啟動(dòng)子，如前列腺特異性抗原(PSA)啟動(dòng)子、激肽釋放酶2 啟動(dòng)子、probasin啟動(dòng)子（用于前列腺癌）、L-plastin啟動(dòng)子（用于乳腺癌、卵巢癌和結(jié)腸 癌）、甲狀腺球蛋白核心啟動(dòng)子（用于甲狀腺癌）、Midkine和環(huán)氧化酶-2啟動(dòng)子（用于胰腺 癌），以及用于大多數(shù)癌癥的人的端粒酶啟動(dòng)子(hTERT)。
[0022] 在其它實(shí)施方案中，提供在第一細(xì)胞和第二細(xì)胞之間產(chǎn)生融合的方法，其包含通 過(guò)向第一細(xì)胞引入本發(fā)明的組合物使第二細(xì)胞膜與第一細(xì)胞膜融合的步驟。在具體實(shí)施方 案中，所述第一細(xì)胞，第二細(xì)胞或第一和第二細(xì)胞都是惡性細(xì)胞，如實(shí)體瘤中的細(xì)胞。適合 用來(lái)實(shí)施本文所描述的方法和組合物的惡性細(xì)胞的非限制性實(shí)例可以包括乳腺癌細(xì)胞、肺 癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、腦癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、甲狀腺 癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、脾癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞和骨癌細(xì)胞。
[0023] 在具體實(shí)施方案中，所述引入步驟被進(jìn)一步定義為向人遞送病毒，例如通過(guò)向人 全身性地遞送病毒。非限制性的給藥途徑可以包括將本文所描述的組合物通過(guò)靜脈內(nèi)、月中 瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)或任何其組合給予。在具體實(shí)施方案中，該組合物被引入大量的細(xì)胞。
[0024] 在其它實(shí)施方案中，提供破壞惡性細(xì)胞的方法，如存在于人體內(nèi)的惡性細(xì)胞，其包 含將本發(fā)明的組合物引入細(xì)胞的步驟，其中在所述引入之后，惡性細(xì)胞的胞膜與另一細(xì)胞 膜融合。
[0025] 在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，有包含本發(fā)明組合物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該哺乳動(dòng)物 細(xì)胞可以是正常的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷性細(xì)胞，或是任何可以作為載體將本發(fā)明 組合物送至腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞類型。
[0026] 在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，本文所述的經(jīng)修飾的HSV-2病毒或病毒載體誘導(dǎo)感 染該病毒的癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，未感染病毒的旁觀細(xì)胞被誘導(dǎo) 凋亡，而非感染了本文所述的經(jīng)修飾的HSV-2病毒的周?chē)?xì)胞。
[0027] 在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，本文所述的病毒或病毒載體包含部分用于測(cè)定病毒 溶解細(xì)胞和或形成合胞體的效力的體系。該體系包含與本文所述的病毒或病毒載體接觸的 細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，如原發(fā)的癌細(xì)胞，或來(lái)自癌細(xì)胞系的 細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以是作為本文所述的病毒或病毒載體的宿主的原核 細(xì)胞。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，還含有病毒或病毒載體的所述細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)。在 本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，還含有病毒或病毒載體的細(xì)胞被置于動(dòng)物中，如小鼠。在本發(fā)明 的其它實(shí)施方案中，所述癌細(xì)胞能夠在接觸病毒或載體之前被移植到動(dòng)物中。
[0028] 前述內(nèi)容相當(dāng)廣泛地概述了本發(fā)明的特征和技術(shù)優(yōu)勢(shì)以便更好地理解以下對(duì)于 本發(fā)明的具體描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解所公開(kāi)的概念和具體實(shí)施方案可以容易地被用 作為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明同樣目的而修飾和設(shè)計(jì)其它結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也會(huì)理解這些 等價(jià)結(jié)構(gòu)不脫離如所附權(quán)利要求中闡述的本發(fā)明的精神和范圍。當(dāng)連同所附實(shí)施例和附圖 考慮時(shí)，那些關(guān)于其組織和操作方法的被認(rèn)為是本發(fā)明特點(diǎn)的新特征以及進(jìn)一步的目的和 優(yōu)勢(shì)將通過(guò)以下描述更好地被理解。然而，應(yīng)當(dāng)清楚地理解，僅出于說(shuō)明和描述的目的提 供每一實(shí)施例和附圖，而不旨在作為對(duì)本發(fā)明限制的闡述。
[0029] 附圖簡(jiǎn)述
[0030] 圖1A-1C顯示Fus0n-H2的構(gòu)建方案。圖1A. HSV-2基因組的圖示?；蚪M由灰色條代 表，末端重復(fù)(TR)和內(nèi)部重復(fù)（IR)由灰色方框表示。也顯示了 ICP10基因的位置。圖1B.放大 的ICP10基因視圖，顯示了PK和RR1結(jié)構(gòu)域及天然啟動(dòng)子的位置。圖1C.隨后被插入病毒基因 組以構(gòu)建Fus0n-H2的經(jīng)修飾的ICP10基因。如圖，PK結(jié)構(gòu)域被EGFP基因取代（與RR基因符合 讀框），基因的原始啟動(dòng)子被最強(qiáng)的哺乳動(dòng)物基因啟動(dòng)子之一的巨細(xì)胞病毒即早期啟動(dòng)子 取代。標(biāo)出了在未修飾和已修飾的ICP10位點(diǎn)中的BamHI限制性酶切位點(diǎn)。被標(biāo)記為PKL、PK、 GFP和PKR的方框表示用于圖2Southern雜交的4個(gè)探針將會(huì)雜交的位置。
[0031 ] 圖2顯示對(duì)Fus0n_H2的Southern印跡分析。Southern印跡雜交顯示了來(lái)自親本野 生型HSV-2(w)或Fus0n-H2(m)的BamHI酶切的病毒體DNA。用于Southern雜交的四個(gè)探針是： 從左翼制備的PKL;從PK結(jié)構(gòu)域制備的PK;從右翼區(qū)域制備的PKR;從EGFP基因制備的GFP。
[0032] 圖3顯示使用抗GFP mAb對(duì)Fus0n_H2進(jìn)行的western印跡分析。細(xì)胞裂解液由感染 了 Fus0n-H2(m)或其親本野生型HSV-2(w)的Vero細(xì)胞，或轉(zhuǎn)染了 pSZ-EGFP質(zhì)粒DNA(p)的 Vero細(xì)胞制備。
[0033]圖4顯示培養(yǎng)細(xì)胞中Fus0n_H2的表形特征。細(xì)胞以O(shè).Olpfu/細(xì)胞感染所標(biāo)明的病 毒或未被感染。顯微照片為感染后24小時(shí)拍攝的。合胞體為白色箭頭所示。在被檢測(cè)的細(xì)胞 中，MDA-MB-435是人乳腺癌細(xì)胞系，MPans-96是人胰腺癌細(xì)胞系，以及SK0V3是人卵巢癌細(xì) 胞系。原始放大倍率:200倍。
[0034]圖5A-C顯示Fus0n-H2的選擇性復(fù)制。圖5A.Vero細(xì)胞被保持處于完全周期狀態(tài) (10%FBS)，或在以lpfu/細(xì)胞被病毒感染前血清饑餓24小時(shí)。在所標(biāo)明的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞， 病毒產(chǎn)量通過(guò)對(duì)單層Vero細(xì)胞進(jìn)行空斑分析進(jìn)行定量。圖5B. Vero細(xì)胞在僅含低比例血清 (2%)的培養(yǎng)基中孵育或在病毒感染期間存在50μΜ PD98059下孵育。在感染后24小時(shí)和48 小時(shí)收集細(xì)胞。病毒復(fù)制的下降倍數(shù)通過(guò)用不含TO98059的孔中的總病毒產(chǎn)量除以含有藥 物的孔中的總病毒產(chǎn)量計(jì)算而得。圖5C.用標(biāo)明的病毒以lpfu/細(xì)胞感染體外培養(yǎng)的原代肝 細(xì)胞。感染后在標(biāo)明的時(shí)間收集病毒并通過(guò)對(duì)單層Vero細(xì)胞的空斑分析進(jìn)行定量。*p〈 0.01，F(xiàn)us0n