耐產(chǎn)物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶HJ5nag及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶及 其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 幾丁質(zhì)是由Ν-乙酰-D-胺基葡萄糖單體通過β_1，4鍵組成的多糖，廣泛存在于真 菌、昆蟲細(xì)胞壁以及甲殼類動(dòng)物外骨骼中，其含量?jī)H次于纖維素，因此幾丁質(zhì)的水解具有重 要的意義。內(nèi)切幾丁質(zhì)酶可以把幾丁質(zhì)降解為幾丁寡糖，而β-N-乙酰葡糖胺酶可催化幾丁 寡糖降解為Ν-乙酰-D-胺基葡萄糖，因而β-Ν-乙酰葡糖胺酶對(duì)幾丁質(zhì)的完全水解起到關(guān)鍵 性的作用；同時(shí)，由于內(nèi)切幾丁質(zhì)酶會(huì)被幾丁寡糖抑制，所以β-Ν-乙酰葡糖胺酶可解除幾丁 寡糖對(duì)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的抑制作用，從而與內(nèi)切幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生協(xié)同作用（Yang et al.， Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62:5181-5190)。但是，大多數(shù)β_Ν_ 乙酰葡糖胺酶易受到水解產(chǎn)物即N-乙酰-D-胺基葡萄糖的抑制，需要耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙 酰葡糖胺酶才能使幾丁質(zhì)更有效地徹底水解(Yang et al·，Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62:5181-5190)。根據(jù)氨基酸序列同源性，β-Ν-乙酰葡糖胺酶主 要?dú)w類于糖苷水解酶第3、20、73和84家族（Cantarel et al.，Nucleic acids research, 2009，37 :D233-D238) J-N-乙酰葡糖胺酶被廣泛應(yīng)用于功能性食品、保健品、化妝品、制藥、 飼料添加劑和生物殺蟲劑等領(lǐng)域（Yang et al·，Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014,62:5181-5190)。例如，β-Ν-乙酰葡糖胺酶水解幾丁寡糖的產(chǎn)物N-乙酰-D-胺基葡萄糖單體具有抗炎作用，對(duì)于潰瘍結(jié)腸炎和其他的胃腸炎癥的治療有很好的效果 (Salvatore et al.,Alimentary pharmacology&therapeutics,2000,14:1567-1579)，N-乙酰-D-胺基葡萄糖也應(yīng)用于治療兒童慢性腸炎疾病以及骨關(guān)節(jié)炎（Shikhman et al.， Annals of the rheumatic diseases，2005,64:89-94)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶及其制備方法，旨在 解決現(xiàn)有的β-N-乙酰葡糖胺酶易受到水解產(chǎn)物即Ν-乙酰-D-胺基葡萄糖的抑制從而導(dǎo)致幾 丁質(zhì)水解效率較低的問題。
[0004] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶，所述耐產(chǎn)物抑制的 β-Ν-乙酰葡糖胺酶的氨基酸序列如SEQ ID Ν0.1所示。
[0005] 進(jìn)一步，所述耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶總共含535個(gè)氨基酸，理論分子量為 55.89kDa，其中Ν端有25個(gè)氨基酸為預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列MNRRRGRAIAAATVLAASLAGCSPA，成熟的 34-乙酰葡糖胺酶耵5仙8含510個(gè)氨基酸。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的制備方 法，所述耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的制備方法包括以下步驟：
[0007] 首先用包含β-Ν-乙酰葡糖胺酶基因 hJ5nag的重組載體，重組載體為pEasy-E2- hJ5nag，將乙酰葡糖胺酶基因插入到表達(dá)載體中，使核苷酸序列與表達(dá)調(diào)控序列相連接，重 組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[0008]然后培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag表達(dá)；
[0009]最后回收所表達(dá)的β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag。
[0010] 進(jìn)一步，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，將重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 細(xì)胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21 (DE3) /hJ5nag。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種包含所述耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的重 組載體。
[0012] 進(jìn)一步，所述重組載體是將β-Ν-乙酰葡糖胺酶的基因插入到表達(dá)載體中，使核苷 酸序列與表達(dá)調(diào)控序列相連接。
[0013] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種包含所述耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的重 組菌株。
[0014]進(jìn)一步，所述重組菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌。
[0015] 本發(fā)明提供的耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶及其制備方法，采用新活性的β-Ν-乙酰葡糖胺酶：最適ΡΗ6;最適溫度為45°C ;可催化水解幾丁寡糖；在反應(yīng)體系加入終濃度 20mM N-乙酰-D-胺基葡萄糖時(shí)，該酶仍保留約69.5 %活性;該酶可與內(nèi)切幾丁質(zhì)酶協(xié)同降 解幾丁質(zhì)。本發(fā)明的β-Ν-乙酰葡糖胺酶可應(yīng)用于海產(chǎn)品加工、醫(yī)學(xué)、功能性食品等行業(yè)。
【附圖說明】
[0016] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的制備方法流程圖。 [0017]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的在大腸桿菌中表達(dá)的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的 SDS-PAGE 分析；
[0018]圖中:Μ:蛋白質(zhì)Marker; CK:含載體pEasy-E2大腸桿菌菌體破碎上清液;S1:含有重 組載體pEasy-E2-hJ5nag的大腸桿菌菌體破碎上清液；S2:純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶 HJ5nag〇
[0019 ]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的pH活性。
[0020]圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的pH穩(wěn)定性。 [0021]圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的熱活性。
[0022]圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的熱穩(wěn)定性。 [0023]圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag水解二乙酰殼二 糖及四乙酰殼四糖的產(chǎn)物分析；
[0024]圖中：M:N-乙酰-D-胺基葡萄糖;CK1:二乙酰殼二糖與滅活的HJ5nag;Sl:二乙酰殼 二糖與有活性的HJ5nag，CK2:四乙酰殼四糖與滅活的HJ5nag;S2:四乙酰殼四糖與有活性的 HJ5nag〇
[0025] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag在不同濃度N-乙 酰-D-胺基葡萄糖中的活性。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0027] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。
[0028] 本發(fā)明所述β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag可得自微桿菌（Microbacterium sp ·)。 HJ5nag的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0029] 微桿菌(Microbacterium sp.)，遺傳資源屬于微生物，獲取方式為自行采集;于 2010年10月，由周峻沛在中國(guó)、云南省、楚雄彝族自治州采集。
[0030] 本發(fā)明的β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag總共含535個(gè)氨基酸，理論分子量為55.89kDa， 其中N端有25個(gè)氨基酸為預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列MNRRRGRAIAAATVLAASLAGCSPA，成熟的β-Ν-乙酰葡 糖胺酶HJ5nag含510個(gè)氨基酸。該酶最適ρΗ6;最適溫度為45°C;可催化水解幾丁寡糖;在反 應(yīng)體系加入終濃度20mM N-乙酰-D-胺基葡萄糖時(shí)，該酶仍保留約69.5 %活性;該酶可與內(nèi) 切幾丁質(zhì)酶協(xié)同降解幾丁質(zhì)。
[0031] 本發(fā)明提供了編碼上述β-Ν-乙酰葡糖胺酶的基因 hJ5nag，該基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0032] 本發(fā)明通過基因組測(cè)序的方法獲得β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的編碼基因 hJ5nag， 其全長(zhǎng)1608bp，起始密碼為ATG，終止密碼為TGA。
[0033] 經(jīng)BLAST比對(duì)，該β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag為糖苷水解酶第20家族序列，其全序列 與GenBank中的Microbacterium sp.Rootl80來源的β-N-乙酰葡糖胺酶序列（WP_ 056119055)具有最高的氨基酸序列一致性，為76.3%。該Microbacterium sp.Rootl80來源 的蛋白只是通過序列相似性判斷為β-Ν-乙酰葡糖胺酶，其活性還未研究，無法得知該蛋白 的pH活性范圍、熱活性范圍及Ν-乙酰-D-胺基葡萄糖的抑制程度等酶學(xué)性質(zhì)。
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