一種包含基孔肯雅病毒全基因組cDNA的DNA分子及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種DNA分子及其用途，具體地，涉及一種包含基孔肯雅病毒全基因 組cDNA的DNA分子、標(biāo)記基孔肯雅病毒DRDE-06株的方法、含有該DNA分子的重組質(zhì)粒及 其構(gòu)建方法、基孔肯雅病毒的感染性克隆及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV)屬于披膜病毒科（Togaviridae)甲病 毒屬（Alphavirus)，該屬的成員還包括羅斯河病毒（Ross River viruses)，塞姆利基森林 病毒（Semliki forest virus)和辛德畢斯病毒（Sindbis virus)等。CHIKV的主要傳播媒 介是埃及伊蚊（Aedes aegypti)和白紋伊蚊（Ae. albopictus)，可導(dǎo)致基孔肯雅熱，其發(fā)病 特征表現(xiàn)為發(fā)熱，肌肉痛和關(guān)節(jié)痛。盡管基孔肯雅熱的死亡率較低，但是近50年來其傳播 范圍迅速擴大，已經(jīng)由起初流行的東非地區(qū)迅速傳播至歐洲、亞洲和大洋洲地區(qū)。特別是東 南亞地區(qū)的印度，印度尼西亞，泰國和越南等國家，近10年來屢有基孔肯雅熱的爆發(fā)流行。 我國在2006-2008年間僅有散發(fā)的輸入性病例的報道，但是2010年廣東東莞地區(qū)爆發(fā)了一 次小規(guī)模的基孔肯雅熱疫情。因此，基孔肯雅熱已成為一種嚴(yán)重威脅人類健康的再發(fā)傳染 病，但是目前仍然無有效的治療藥物和預(yù)防用疫苗。
[0003] CHIKV是一種包膜病毒，基因組是長度約為12 kb的單股正鏈RNA，含有兩個讀碼 框，分別編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白C、包膜蛋白E1和E2)和4個非結(jié)構(gòu)蛋白（nsPl-4)。 RNA病毒的全長感染性cDNA克隆經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄后可獲得具有感染性的病毒RNA，再轉(zhuǎn)染細(xì)胞 后獲得拯救病毒。這極大方便了我們對病毒基因組序列進行定向改造，從而獲得具有新性 狀的突變病毒。通過比較野生病毒與突變病毒生物學(xué)性質(zhì)的變化，可以確定病毒關(guān)鍵的毒 力位點，篩選出病毒關(guān)鍵的抗原表位，為疫苗設(shè)計提供靶點。因此，病毒的感染性全長cDNA 克隆是深入研究病毒復(fù)制及致病機制的基礎(chǔ)。
[0004] 合成生物學(xué)的基本原理是通過基因組數(shù)據(jù)庫獲得擬合成的目的基因信息，再采用 體外化學(xué)合成的方法獲得相應(yīng)的基因序列，進而將其導(dǎo)入特定細(xì)胞或組織中，最終拯救獲 得具有生物學(xué)活性的生命體。合成生物學(xué)為病毒的感染性克隆的構(gòu)建方法開辟了新的方 向，如通過全基因合成的方法獲得了造成1918年大流感病毒株的基因組序列，并成功拯救 出具有生物學(xué)活性的流感病毒，有力地推動了流感病毒的生物學(xué)性質(zhì)的研究。
[0005] 通過化學(xué)合成方法獲得一個生命體的基因序列已成為目前生命科學(xué)領(lǐng)域的研究 熱點，極大地方便研究生命本質(zhì)的同時，也帶來了許多問題。人工合成一個自然界并不存在 的全新序列，其生物學(xué)性質(zhì)不得而知，生物安全性評價亟待解決。一旦發(fā)生生物泄漏事故， 如何區(qū)分人工合成序列與自然進化的序列就顯得尤為重要，因此獲取有效的區(qū)分方法意義 重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種突變的基孔肯雅病毒基因組cDNA，從而獲得能夠與野生 的基孔肯雅病毒相區(qū)分的感染性克隆。
[0007] 為了區(qū)分人工合成和自然進化的生物基因序列，本發(fā)明的發(fā)明人進行了大量實 驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在特定位點引入了兩個核苷酸突變（第7522-7523位突變?yōu)門T)，不會影響病 毒的感染性等特征。進一步通過序列比對發(fā)現(xiàn)，上述突變在自然進化的序列中均未出現(xiàn)，因 此是區(qū)分人工合成和自然進化的標(biāo)簽，便于對該序列生物安全性的評價。
[0008] 因此，為了實現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種包含基孔肯雅病毒全基因 組cDNA的DNA分子，該DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示。本發(fā)明提供的DNA分 子可用作基孔肯雅病毒的基因組感染性全長cDNA克隆，且能夠獲得感染性與野生病毒相 當(dāng)?shù)幕卓涎挪《尽?br>[0009] 第二方面，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒含有SEQ ID N0 :1所示的核苷 酸序列。
[0010] 所述重組質(zhì)?？梢园▎幼拥仍?，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，所述重組質(zhì) 粒為在質(zhì)粒PUC18的Sbf I酶切位點和Sap I酶切位點之間依次連接有啟動子序列、SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列、多聚腺苷酸序列以及選擇性含有的用于PCR鑒定的特異序列 的重組質(zhì)粒。
[0011] 更優(yōu)選地，所述啟動子為Sp6啟動子（序列為5'-GATTCCAATCTCGAGATTTAGGTGACA CTATAG-3'，SEQ ID NO :2)。
[0012] 用于PCR鑒定的特異序列是方便PCR檢測的一段序列，屬于重組質(zhì)粒 中選擇性含有的序列，進一步優(yōu)選地，用于PCR鑒定的特異序列如SEQ ID N0 : 3(5' -CCTCGACTGTGCCTTCTAAAT-3'）所示。
[0013] 所述多聚腺苷酸序列可以為常規(guī)的多聚腺苷酸序列，如SEQ ID N0:4(5'-AAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAT-3'）所示的序列 。
[0014] 第三方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法，如圖1所示，該方法包括以下 步驟：
[0015] (1)通過化學(xué)合成法獲得DNA片段F1和DNA片段F2,其中，DNA片段F1的序列由 啟動子序列和SEQ ID N0 :1第1-7733位核苷酸所示的序列組成，DNA片段F2的序列由SEQ ID N0 :1第7310-11774位核苷酸所示的序列、多聚腺苷酸序列和選擇性含有的用于PCR鑒 定的特異序列組成；
[0016] (2)使用Sbf I和Sap I對DNA片段F1進行酶切，從而將酶切后的DNA片段F1插 入質(zhì)粒PUC18的Sbf I酶切位點和Sap I酶切位點之間，得到pUC18-5,使用Sbf I和Sap I對DNA片段F2進行酶切，從而將酶切后的DNA片段F2插入質(zhì)粒pUC18的Sbf I酶切位點 和Sap I酶切位點之間，得到pUC18-3 ;
[0017] (3)使用BssH II和Sap I對pUC18-5和pUC18-3進行酶切，進一步連接酶切所 得的大片段，得到重組質(zhì)粒PCHIKV-FL。本發(fā)明的重組質(zhì)粒pCHIKV-FL中，在質(zhì)粒pUC18的 Sbf I酶切位點和Sap I酶切位點之間依次連接有啟動子序列、SEQ ID N0 :1所示的核苷酸 序列、多聚腺苷酸序列以及選擇性含有的用于PCR鑒定的特異序列。
[0018] 其中，啟動子序列、多聚腺苷酸序列以及用于PCR鑒定的特異序列的具體選擇如 前所述?；瘜W(xué)合成DNA片段的方法包括液相合成法和固相合成法，通?？晌袑ｉT的公司 (如上海英駿生物技術(shù)有限公司）進行合成，在此不再贅述。通過酶切法在質(zhì)粒的特定酶切 位點之間插入目的片段的具體操作步驟為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此也不再贅述。
[0019] 第四方面，本發(fā)明提供了一種基孔肯雅病毒的感染性克隆，該感染性克隆的基因 組RNA對應(yīng)的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0020] 第五方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建基孔肯雅病毒的感染性克隆的方法，該方法包 括將第二方面所述的重組質(zhì)粒進行體外轉(zhuǎn)錄，將得到的轉(zhuǎn)錄體RNA轉(zhuǎn)染敏感細(xì)胞。優(yōu)選地， 所述敏感細(xì)胞為BHK-21細(xì)胞。
[0021] 第六方面，本發(fā)明提供了一種標(biāo)記基孔肯雅病毒DRDE-06株的方法，該方法包 括將基孔肯雅病毒DRDE-06株基因組RNA對應(yīng)的cDNA的第7522-7523位核苷酸由TT 突變?yōu)?GG?；卓涎挪《?DRDE-06 株已在"Santhosh，S.R. et al, Comparative full genome analysis revealed El:A226V shift in 2007 Indian Chikungunya virus isolates，Virus Res. 135(1) :36-41 (2008)" 中公開。
[0022] 本發(fā)明具有如下優(yōu)勢：
[0023] (1)本發(fā)明基于化學(xué)合成技術(shù)構(gòu)建了基孔肯雅病毒全長感染性cDNA克隆