一種與致病力相關(guān)的灰霉病菌基因BcCpo1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及植物保護(hù)領(lǐng)域中控制真菌致病性的 基因及其編碼蛋白質(zhì)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 灰霉病菌(Botrytis cinerea)通常又稱作灰葡萄孢，屬于子囊菌門（Ascomycota) 真菌，是灰霉病的病原菌，可侵染200多種植物，包括幾乎所有的蔬菜及果樹。寄主從苗期、 掛果期到貯存期均可發(fā)病，而且，植株各部位均可被灰霉病菌侵染，葉部發(fā)病的典型癥狀表 現(xiàn)為"V"形病斑，花部主要表現(xiàn)為腐爛和調(diào)萎，果實(shí)主要表現(xiàn)為腐爛和脫落。病害的發(fā)生和 蔓延與環(huán)境的濕度、溫度存在密切的關(guān)系，在20°C_23°C，相對(duì)濕度90%以上時(shí)發(fā)生嚴(yán)重。因 此，灰霉病屬低溫高濕型病害，在多雨季節(jié)或者保護(hù)地生產(chǎn)中極易發(fā)生，世界上每年因該病 導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)100-1000億美元。由于寄主范圍廣泛，生產(chǎn)上危害嚴(yán)重，再加上相關(guān)分 子研究技術(shù)成熟，灰霉病菌已成為最重要的模式植物病原真菌之一，受到廣泛研究。
[0003] 灰霉病菌是典型的死體營養(yǎng)型病原真菌，可生成多種致病因子參與致病，主要包 括細(xì)胞壁降解酶類、角質(zhì)酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反應(yīng)的酶類、小RNA及小分子物質(zhì)等， 這些因子相互協(xié)作使灰霉病菌能夠殺死寄主細(xì)胞，并分解死亡的寄主組織作為營養(yǎng)。自然 條件下，灰霉菌多以分生孢子作為侵染寄主的初侵染和再侵染來源。灰霉病菌常以菌絲體、 分生孢子或菌核附著在植物病殘?bào)w上，或在土壤中越冬和越夏，成為下一生長季的初侵染 來源。當(dāng)條件適宜時(shí)，菌核萌發(fā)產(chǎn)生菌絲體和分生孢子梗，并產(chǎn)生大量的分生孢子。成熟的 分生孢子能夠借助風(fēng)、雨水、灌概水和農(nóng)事操作等進(jìn)行傳播。在低溫高濕條件下，分生孢子 萌發(fā)形成芽管，芽管末端稍稍膨大發(fā)育成附著胞或者進(jìn)一步形成侵染墊等侵染結(jié)構(gòu)，主要 從衰敗的花器、傷口以及壞死組織侵入。
[0004] 當(dāng)高濃度的灰霉病菌分生孢子侵染寄主時(shí)，發(fā)病迅速，此時(shí)主要通過芽管頂端形 成的附著胞侵入;伴隨孢子濃度降低，通過芽管頂端侵入的比例降低，發(fā)病速度也相應(yīng)延緩 1-4天，此時(shí)主要通過由菌絲發(fā)育成的附著胞或侵染墊侵入?；颐共【秩爰闹骷?xì)胞后，將 會(huì)直接面臨寄主組織內(nèi)敵對(duì)環(huán)境的挑戰(zhàn)，病原菌必須迅速做出調(diào)整，一方面抑制植物的防 御反應(yīng)，另一方面要積極適應(yīng)寄主細(xì)胞內(nèi)物理、化學(xué)環(huán)境，做到這兩方面，灰霉病菌才有望 成功地寄生植物。在很大程度上，灰霉病菌是通過改變自身的代謝途徑，并分泌相關(guān)效應(yīng)因 子(如毒素)來實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的，但參與相應(yīng)過程的基因、蛋白及代謝產(chǎn)物及其調(diào)控的分子 機(jī)制仍所知甚少。對(duì)該領(lǐng)域進(jìn)行深入研究，鑒定灰霉病菌用以適應(yīng)寄主內(nèi)環(huán)境的關(guān)鍵因子， 不僅有助于揭示灰霉病菌這種死體營養(yǎng)型病原真菌致病的分子機(jī)制，還有可能從中發(fā)現(xiàn)可 以作為殺真菌劑作用靶標(biāo)的蛋白質(zhì)，為開發(fā)防治灰霉病及其它類似病害的高效藥劑奠定理 論和技術(shù)基礎(chǔ)。
[0005] Cpol是一種糞卟啉原III氧化酶，參與催化血紅素合成途徑的第六步反應(yīng)。該蛋白 廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌等生物，由于血紅素可以作為眾多蛋白的輔基參與多種 生命過程，因此，作為催化血紅素合成酶類之一的Cpol蛋白質(zhì)具有重要的功能。Cpol蛋白質(zhì) 在灰霉病菌中同樣存在，而且功能尚未獲得鑒定，通過分析灰霉病菌Cpo 1編碼基因的致病 功能，評(píng)價(jià)該基因在灰霉病菌發(fā)育及致病過程的作用，有利于鑒定潛在的防治靶標(biāo)，用于篩 選新型殺真菌藥劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的旨在提供一種控制致病性的基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
[0007] 本發(fā)明所提供的控制致病性基因來源于灰霉病菌，名稱為BcCpol，其DNA序列如 SEQ ID No:l所示。該DNA序列為BcCpol基因開放閱讀框，由1074個(gè)核苷酸組成，其中包含2 個(gè)外顯子，分別位于SEQ ID No: 1的5'端第1位至3位核苷酸之間和第58位至1074位核苷酸 之間，組成的編碼區(qū)長度合計(jì)為1020個(gè)核苷酸。
[0008] 本發(fā)明提供了BcCpol基因所編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID No: 2所示，該 序列由339個(gè)氨基酸組成。
[0009] 來自灰霉病菌的控制致病性基因 BcCpo 1可應(yīng)用于植物抗灰霉病基因工程領(lǐng)域。
[0010] 對(duì)來自灰霉病菌的控制致病性基因 BcCpol所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行缺失、突變或修飾 而使其致病力發(fā)生缺陷，可作為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥劑中應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明證明了 BcCpol基因的缺失或突變，會(huì)導(dǎo)致灰霉病菌致病力顯著降低，說明 BcCpol基因是灰霉病菌引起農(nóng)作物灰霉病所必需的基因。因此，篩選能夠阻止該基因表達(dá) 與其蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾及定位的化合物，可以有效控制灰霉病的發(fā)生，從而有助于開發(fā)新 型殺菌劑，即本發(fā)明所提供的BcCpol基因的一個(gè)重要用途是：該基因的表達(dá)與其編碼的蛋 白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)、修飾及定位，可以作為重要候選靶標(biāo)位點(diǎn)，用于抗真菌藥劑(特別是抗灰 霉病菌藥劑)的設(shè)計(jì)和篩選。
【附圖說明】
[0012]圖1為BcCpol蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域分析示意圖
[0013] 其中：Coproporphyrinogen III oxidase為奠卟啉原III氧化酶結(jié)構(gòu)域；
[0014]圖2為灰霉病菌BcCpol基因的RNA干擾載體構(gòu)建示意圖
[0015]其中：pCpo 1 -Ri為干擾載體;PtrpC為構(gòu)巢曲霉trpC基因的啟動(dòng)子;Cpo-f為BcCpo 1 基因編碼區(qū)的一個(gè)片段(長432bp)，按照正反兩個(gè)方向先后插入兩段；IT為一段內(nèi)含子(長 130bp); TtrpC為構(gòu)巢曲霉trpC基因的終止子；
[0016]圖3為BcCpol基因干擾突變體中殘存的BcCpol蛋白質(zhì)水平檢測(cè)
[0017] 其中：所用檢測(cè)方法為western blot。町為野生型菌株B05.10，M1為BcCpol基因干 擾突變體。所用一抗:Anti-Cpol為人類Cpol蛋白的一抗，Anti-Actin為酵母Actin蛋白的一 抗，用作內(nèi)參；
[0018] 圖4為BcCpo 1基因的RNA干擾突變體與野生型菌株的致病力比較照片
[0019] 其中:所選擇寄主為番茄，采用離體葉片接種菌餅的方法，接種3天后進(jìn)行評(píng)價(jià)；
[0020] 圖5為BcCpol基因的突變體與對(duì)照菌株侵染寄主所產(chǎn)生病斑大小的定量分析示意 圖
[0021] 其中：接種方法同上，接種3天后對(duì)葉片病斑面積進(jìn)行測(cè)量計(jì)算，換算成相對(duì)大 小。**表示在ρ〈0·01水平上差異顯著。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為了更好地描述本發(fā)明，下面通過具體的實(shí)施例予以進(jìn)一步的說明，下述實(shí)施例 中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0023]實(shí)施例1 BcCpol基因的相關(guān)性分析
[0024]灰霉病菌BcCpol基因的開放閱讀框由1074個(gè)核苷酸組成，包含2個(gè)外顯子，編碼區(qū) cDNA全長為1020個(gè)核苷酸，編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物由339個(gè)氨基酸組成。取BcCpol蛋白質(zhì)序列進(jìn) 行比對(duì)分析(http://blast .ncbi .nlm.nih.gov/Blast.