釀酒酵母基因工程改造提高s-腺苷-l-蛋氨酸產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)、代謝工程領(lǐng)域，涉及一種通過代謝途徑改造來提高釀酒 酵母菌株生產(chǎn)s-腺苷-L-蛋氨酸能力的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] S-腺苷-L-蛋氨酸，簡稱SAM，廣泛存在于動物、植物和微生物細(xì)胞中，是一種重要 的代謝中間產(chǎn)物。作為胞內(nèi)甲基供體，SAM在核酸、蛋白質(zhì)以及脂類等分子的甲基化修飾中 扮演重要角色。同時，SAM還參與胞內(nèi)的轉(zhuǎn)硫基反應(yīng)以及聚胺的合成等重要生化反應(yīng)。SAM也 是一種非常有價值的醫(yī)藥分子，在治療肝病、抑郁癥和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要作用。
[0003] SAM在胞內(nèi)是經(jīng)過腺苷蛋氨酸合成酶催化，由蛋氨酸和三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合生成 的。研究標(biāo)明，胞質(zhì)內(nèi)過量的SAM對細(xì)胞毒害作用非常強(qiáng)，SAM不能在細(xì)胞液中大量貯存。然 而，酵母一類微生物卻能在富含蛋氨酸的環(huán)境中大量合成并積累SAM，這是因為酵母細(xì)胞的 液泡中含有大量的帶負(fù)電荷的聚磷酸鹽，這些聚磷酸鹽能固定住帶正電荷的SAM。因此，酵 母成為了工業(yè)生產(chǎn)SAM的首選宿主。
[0004] 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有遺傳背景清楚、食品級安全、抗逆性 強(qiáng)以及發(fā)酵條件容易控制等許多優(yōu)良特性，因此被廣泛用作食品、醫(yī)藥以及化工工業(yè)的生 產(chǎn)菌株。盡管天然的釀酒酵母生產(chǎn)腺苷蛋氨酸能力已經(jīng)很強(qiáng)，但還是不能滿足市場日益增 長的需求，尋求更多途徑繼續(xù)提高腺苷蛋氨酸的產(chǎn)量的任務(wù)迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為滿足腺苷蛋氨酸日益增長的工業(yè)生產(chǎn)需求，提供一種釀酒酵母 基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸產(chǎn)量的方法。為此，針對工業(yè)中經(jīng)常采用的雙倍體菌 株，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 釀酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸產(chǎn)量的方法，其特征在于，對釀酒酵母菌 株糖原合成途徑進(jìn)行了敲除。
[0006] 進(jìn)一步地，所述對釀酒酵母菌株糖原合成途徑的敲除是通過敲除釀酒酵母菌株染 色體上糖原支鏈酶基因 GLC3來實現(xiàn)的。
[0007] 進(jìn)一步地，所述釀酒酵母菌株采用釀酒酵母雙倍體菌株，對所述釀酒酵母雙倍體 菌株實施所述敲除包括以下步驟： 步驟1:設(shè)計含有GLC3基因同源臂的引物，以質(zhì)粒pUG6為模版進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)過純 化得到GLC3基因的敲除框； 步驟2:通過醋酸鋰(LiAC)轉(zhuǎn)化法將步驟1中所得敲除框?qū)脶劸平湍鸽p倍體菌株中， 通過G418平板篩選以及PCR驗證，得到一條GLC3等位基因被置換的雜合子； 步驟3:將步驟2得到的雜合子置于產(chǎn)孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)至孢子大量產(chǎn)生，收集孢子，溶解 孢子子囊壁后，分離孢子； 步驟4:將步驟3得到的分離孢子置于G418平板上培養(yǎng)至菌落生成，挑取單菌落進(jìn)行PCR 驗證。
[0008] 進(jìn)一步地，所述釀酒酵母菌株采用釀酒酵母單倍體菌株，對所述釀酒酵母單倍體 菌株實施所述敲除包括以下步驟： 步驟1:設(shè)計含有GLC3基因同源臂的引物，以質(zhì)粒PUG6為模版進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)過純 化得到GLC3基因的敲除框； 步驟2:通過醋酸鋰(LiAC)轉(zhuǎn)化法將步驟1中所得敲除框?qū)脶劸平湍竼伪扼w菌株中， 通過G418平板篩選，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗證。
[0009] 進(jìn)一步地，所述步驟1中設(shè)計含有GLC3基因同源臂的引物，該引物序列為： 上游引物GLC3-up: CCCTGATAACTTCCTGTTACTATTTAAGAACACCAAACCAAGTATAAAGACAGCTGAAGCTTCGTACGC, 下游引物GLC3_down: TATTGAGTCTTGATTTTCAGTAAGCAATATAGTATAGAGTTCATTCTTTTGCATAGGCCACTAGTGGATCTG。 [0010] 進(jìn)一步地，所述步驟2中通過G418平板篩選以及PCR驗證，該PCR驗證的引物序列 為： 上游引物 GLC3-A: 5 ' -CCCTGATAACTTCCTGTTAC-3 ' 下游引物GLC3-D: 5 ' -GAGTCTTGATTTTCAGTAAG-3 ' 進(jìn)一步地，所述步驟3中溶解孢子子囊壁后，分離孢子，具體為:400微升孢子懸浮液中 加入10微升蝸牛酶溶液，37°C下水浴3h，然后用100w超聲振蕩處理5s，間歇7s，振蕩5個周 期;顯微鏡下確認(rèn)孢子充分分離。
[0011]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的提高釀酒酵母菌株生產(chǎn)s-腺苷-L-蛋氨酸的方 法，采用將GLC3基因敲除菌株進(jìn)行發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)SAM。
[0012]進(jìn)一步地，其發(fā)酵培養(yǎng)基成分具體為：10g/L葡萄糖，3g/L酵母粉，5g/L硫酸 銨，10g/L磷酸二氫鉀，3g/L硫酸鎂，0.1g/L七水硫酸錳，0.6 g/L七水硫酸鋅， 0.55g/L硫酸亞鐵，0.5g/L氯化鈉，0.5g/L氯化|丐，1.6mg/L硫酸銅，4.84mg/L鉬酸 銨，0.3mg/L生物素，3.6mg/L泛酸f丐，3.6mg/L微生物Bi, 3.6mg/L維生素 B6。
[0013] 腺苷蛋氨酸合成的直接底物只有蛋氨酸和ATP，添加外源蛋氨酸能快速加劇釀酒 酵母合成SAM，是最直接最有效率的提高SAM產(chǎn)量的方法。已有大量研究報道，過量表達(dá)腺苷 蛋氨酸合成酶也是提高SAM合成效率的有效手段。然而，通過代謝改造使ATP更多流入SAM合 成途徑這一塊的研究報道卻很少。事實上，減少胞內(nèi)ATP不必要的消耗，提高胞內(nèi)ATP活性， 對提高釀酒酵母胞合成SAM效率也是十分重要的。
[0014] 研究表明，釀酒酵母會在穩(wěn)定期大量合成糖原，消耗碳源并且降低了胞內(nèi)ATP活 性。而在SAM工業(yè)生產(chǎn)中卻是在穩(wěn)定期加入外源蛋氨酸，促使釀酒酵母來合成SAM;因此，糖 原合成途徑對于工業(yè)生產(chǎn)SAM來講是一條浪費資源的途徑。而GLC3基因編碼的糖原支鏈酶 GBE是糖原合成途徑的關(guān)鍵酶，已經(jīng)有報道指出，GLC3基因的突變?nèi)笔苤苯訉?dǎo)致宿主糖原 合成途徑的缺失。因此，敲除GLC3這一個基因能達(dá)到敲除糖原合成途徑，而糖原途徑的去除 有望提高釀酒酵母的碳源利用率，提高胞內(nèi)ATP的活性，進(jìn)而促使SAM的合成與積累。
[0015] 由于采用本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明取得的優(yōu)點和有益效果是:本發(fā)明能夠適用 于各種釀酒酵母菌株。本發(fā)明從一個新角度對該菌株進(jìn)行了代謝途徑的改造，結(jié)果表明，糖 原途徑缺失突變菌株的腺苷蛋氨酸產(chǎn)量達(dá)到了 7.93g/L，比原始菌株提高了 15.1%，從而可 以提高SAM的工業(yè)生產(chǎn)效率。另外，本發(fā)明采用了孢子分離技術(shù)來得到純合的二倍體敲除菌 株，可以避免先單倍體分開敲除再融合的繁瑣過程，提高了二倍體的敲除效率，且其為釀酒 酵母工業(yè)菌株，其本身具有的強(qiáng)腺苷蛋氨酸積累能力、優(yōu)良的發(fā)酵特性以及食品安全的生 物性能，都是其它微生物不能比擬的，具有更好的技術(shù)效果。
【附圖說明】
[0016] 圖1為驗證GLC3基因敲除過程的核酸凝膠電泳圖。以GLC3-A和GLC3-D為引物，分別 對HD、HD-glc3雜合子、HD-glc3純合子進(jìn)行PCR驗證。
[0017] 圖2為10L發(fā)酵過程中HD與HD-glc3的SAM產(chǎn)量對比圖。SAM concentration即為SAM 濃度;Time為時間。底物蛋氨酸加入后開始計時，比較原始菌株HD與糖原合成途徑缺失菌株 HD-glc3的SAM生產(chǎn)能力。
【具體實施方式】
[0018] 實施例1:以雙倍體釀酒酵母菌株HD為例，構(gòu)建GLC3基因敲除的雜合子。
[0019] 1、PCR構(gòu)建敲除框。方法如下：以質(zhì)粒PUG6為模版，用引物對GLC3-UP和GLC3-down 進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物利用DNA純化試劑盒純化回收，經(jīng)過DNA電泳確認(rèn)，最終作為GLC3基因 敲除用的敲除框。
[0020] 2、LiAC轉(zhuǎn)化。方法如下：挑原始菌株HD單菌落置于20mL YPD搖瓶中，轉(zhuǎn)速200rpm， 30°C過夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接2mL到50mL YH)搖瓶中繼續(xù)培養(yǎng)3-4個小時，0D6Q()大約為1的時候離 心收集菌體。用20mL無菌水洗滌一次，離心，去掉上清;再用0.1 M LiAC洗滌一次，離心，去 掉上清；用lmL 0.1M LiAC重懸菌體，轉(zhuǎn)移到2mL離心管，再加入0.5mL 0.1M LiAC重懸菌體； 分裝為每管50此，取兩管，分別離心去上清，得到感受態(tài)細(xì)胞;按順序加入240yL PEG、36yL 1 M LiAC、50yL ssDNA和34yL GLC3敲除框，然后混勻，放置室溫15min，再進(jìn)行42°C熱激 20min;離心，去上清，再加入lmL YH)培養(yǎng)基，30°C預(yù)培養(yǎng)2h;離心，去上清，加入2mL無菌水 重懸，取50-100yL涂布到200yg/mL G418 YPD平板上，30°C培養(yǎng)36-48h。
[0021] 3、PCR驗證。方法如下：在上述G418平板上挑菌落4-6個，進(jìn)行PCR驗證。如附圖1， DNA凝膠電泳得到雙條帶的菌株即為敲除雜合子。
[0022] 實施例2:以雙倍體釀酒酵母菌株HD為例，分離孢子單倍體并得到敲除純合子。
[0023] 方法如下：將實施例1所得敲除雜合子涂布到麥?zhǔn)袭a(chǎn)孢培養(yǎng)基（葡萄糖lg/L、KCl 1.8g/L、醋酸鈉 8.2 g/L以及瓊脂15 g/L)上培養(yǎng)3-4天，顯微鏡下確認(rèn)孢子產(chǎn)率超過95%;收 集少量孢子，加入400yL蝸牛酶反應(yīng)液(來自上海生工酵母基因組提取試劑盒），懸浮孢子， 再加入10微升蝸牛酶溶液，37°C下水浴3h;離心，用500yL無菌水重懸，再100W超聲振蕩處理 5s，間歇7s，振蕩5個周期;最后，顯微鏡下確認(rèn)孢子比較充分地分離(分離率大于80%)，用接 種環(huán)取少量菌液劃線到200yg/mL的G418 YH)平板上，30°C下培養(yǎng)36-48h。挑取4-6個菌落， 用引物對GLC3-A和GLC3-D進(jìn)行PCR驗證。如附圖1，DNA凝膠電泳只得到一條含敲除框大小的 條帶的菌株即為敲除