從含酶切位點(diǎn)的融合蛋白中純化蛋白的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本申請涉及一種從融合蛋白純化蛋白的方法，具體涉及一種節(jié)約程序與成本的酶 切純化蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶固定化技術(shù)在生物技術(shù)領(lǐng)域已有使用的先例，比如生物柴油技術(shù)，食品工程，廢 水處理等，但是在制藥領(lǐng)域還沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)的技術(shù)報(bào)道。融合蛋白技術(shù)是為獲得大量標(biāo)準(zhǔn) 蛋白而進(jìn)行的有目的性的基因融合，利用融合蛋白技術(shù)，可構(gòu)建和表達(dá)具有多種功能的新 型目的蛋白。例如，有些融合蛋白是含有凝血酶或者腸激酶酶切位點(diǎn)的硫氧還蛋白和目的 蛋白融合表達(dá)，在后續(xù)純化中采用凝血酶或者腸激酶將硫氧還蛋白和目的蛋白切開，并采 用多步柱層析將這兩種蛋白分開，達(dá)到預(yù)期的純化效果。因此要得到目的蛋白需分為兩個(gè) 步驟:酶切和純化。目前通過基因工程手段表達(dá)有特殊標(biāo)記的融合蛋白技術(shù)已經(jīng)非常成熟， 現(xiàn)有技術(shù)中采用靜態(tài)酶切法，將目的蛋白置換到相應(yīng)的酶切溶液內(nèi)，靜態(tài)酶切一定的時(shí)間， 然后用不同的層析柱達(dá)到分離純化的目的。
[0003] 目前的酶切技術(shù)通常采用的靜態(tài)酶切法，是將酶和底物蛋白充分混勻后，在合適 的酶切條件下酶將融合蛋白切成目的蛋白和融合頭，此時(shí)，酶只對它周圍能接觸到的蛋白 產(chǎn)生酶切作用，酶切效率低，酶用量大，另外，酶和蛋白同時(shí)溶解在一種溶媒內(nèi)，后續(xù)目的蛋 白純化中會(huì)有酶殘留的問題。而且酶切時(shí)間長，酶和蛋白同時(shí)溶解在一種溶媒內(nèi)，不僅給后 續(xù)目的蛋白純化帶來影響，而且殘留的酶對蛋白有進(jìn)一步的酶切，使酶切終點(diǎn)不好控制，酶 切的變異性增加。經(jīng)過酶切的蛋白通常需要采用進(jìn)一步的層析進(jìn)行純化，如果接下來純化 不能有效去除酶，則殘留的酶會(huì)繼續(xù)發(fā)揮作用，從而引入額外的雜質(zhì)，無法有效的純化目的 蛋白。經(jīng)過酶切的蛋白溶液內(nèi)成分較復(fù)雜，如果按照常規(guī)的層析方法，目的蛋白吸附在層析 介質(zhì)上，然后再根據(jù)其不同的表面電荷和疏水性等物理性質(zhì)將目的蛋白和雜蛋白分開，勢 必要經(jīng)過多步層析，每一步層析柱都需要至少五種溶液來完成層析步驟，整個(gè)層析工藝比 較復(fù)雜。每增加一步柱層析，會(huì)增加很多工作量，同時(shí)蛋白的回收率也會(huì)下降，因此用盡可 能少的層析步驟達(dá)到相同的純化效果是純化工藝的最佳境界。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本申請?jiān)诘鞍准兓に囍?，發(fā)明人巧妙地設(shè) 計(jì)了一種可以一步純化的方法:采用串聯(lián)的兩個(gè)層析柱一次純化目的蛋白，大大縮減了成 本和時(shí)間。具體而言，首先，將酶固定在介質(zhì)上，然后將介質(zhì)裝到層析柱內(nèi)，制成酶切層析 柱，將固定有酶的層析柱和另一根有特定介質(zhì)的層析柱串聯(lián)，當(dāng)融合蛋白在特定的緩沖條 件下流經(jīng)該串聯(lián)的裝置，目的蛋白直接從串聯(lián)柱流穿，雜蛋白吸附在層析介質(zhì)上，這樣一步 層析就可以得到高純度的目的蛋白。
[0005] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種一步從含有酶切位點(diǎn)的融合蛋白中純化蛋 白的方法，包括如下步驟：
[0006] 將能夠?qū)λ雒盖形稽c(diǎn)特異性酶切的酶固定在第一層析柱內(nèi)的介質(zhì)上；
[0007] 將固定有酶的第一層析柱與第二層析柱串聯(lián)，所述第二層析柱能夠吸附所述融合 蛋白的非目的蛋白（下文中也稱為融合頭)部分，并且不會(huì)吸附目的蛋白；
[0008] 將含有所述融合蛋白的樣品依次流經(jīng)第一層析柱和第二層析柱。依照此方法，可 以一步獲得高純度的目的蛋白，大大節(jié)省了成本，并且避免了多種雜蛋白的產(chǎn)生。
[0009] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述酶為凝血酶、腸激酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰 蛋白酶。在實(shí)際操作中，可以根據(jù)這些酶的酶切位點(diǎn)來設(shè)計(jì)融合蛋白的結(jié)構(gòu)，以便能夠利用 上述酶有效切得目的蛋白。
[0010] 在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述第一層析柱內(nèi)的介質(zhì)選自高交聯(lián)的瓊脂 糖、葡聚糖和纖維素中的一種。采用適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒?，能夠?qū)⒚腹潭ǖ竭@些介質(zhì)上。
[0011] 在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述第二層析柱選自用于純化含有標(biāo)簽蛋白的親和 層析填料、離子交換類填料和分子篩類填料中的一種。具體而言，第二層析柱內(nèi)的介質(zhì)的選 擇有幾種情況：
[0012] 當(dāng)融合蛋白表達(dá)時(shí)含有標(biāo)簽的，第二層析柱選擇用于純化標(biāo)簽蛋白的親和層析填 料，例如，純化his標(biāo)簽蛋白時(shí)，就選擇Ni親和填料，純化BMP標(biāo)簽蛋白時(shí)，選用Dextrin Sepharose系列的填料，純化Strep(II)標(biāo)簽蛋白時(shí)，選擇StrepTactin Sepharose系列填 料，純化GST標(biāo)簽蛋白時(shí)選用Glutathione Sepharose FF系列填料；
[0013] 當(dāng)融合蛋白表達(dá)沒有標(biāo)簽時(shí)，對融合蛋白、目的蛋白和酶切后的非目的蛋白部分 進(jìn)行分析，當(dāng)目的蛋白等電點(diǎn)偏堿性，而全長融合蛋白和酶切后的非目的蛋白等電點(diǎn)偏酸 性，則可以選擇陰離子交換系列介質(zhì)作為第二層析柱的介質(zhì)，（例如強(qiáng)陰離子交換Q sepharose系列、弱陰離子DEAE Sepharose FF);當(dāng)目的蛋白等電點(diǎn)偏酸性，而全長融合蛋 白和酶切后的非目的蛋白等電點(diǎn)偏堿性，則可以選擇陽離子交換系列介質(zhì)作為第二層析柱 的介質(zhì)（例如強(qiáng)陽離子層析介質(zhì)SP Sepharose系列和弱陽離子CMSepharoseFF)。
[0014] 當(dāng)酶切后的目的蛋白和融合蛋白分子量差異很大時(shí)，第二層析柱可以選擇分子篩 介質(zhì)，流動(dòng)相經(jīng)過時(shí)，收集不同的組分(例如:Superdex系列和Sephacryl系列）。第一層析柱 中所述酶的固定在4±2°C，pH8-8.5條件下進(jìn)行12-20小時(shí)，可以根據(jù)具體的酶和第一層析 柱的選擇具體優(yōu)化固定酶的條件，例如可優(yōu)選4°C，pH8.0，固定16小時(shí)。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種純化蛋白的試劑盒，包括第一層析柱和第二層析柱，其中第 一層析柱中的介質(zhì)固定有能夠從融合蛋白酶切得到目的蛋白的酶，第二層析柱中的介質(zhì)能 夠吸附所述融合蛋白被酶切后的非目的蛋白部分，并且不會(huì)吸附所述目的蛋白，所述試劑 盒在使用時(shí)依次串聯(lián)連接第一層析柱和第二層析柱。酶和層析柱可選的種類如上述方法中 所述。
[0016] 利用所述試劑盒可以實(shí)現(xiàn)上述純化方法，并且，對于特定的融合蛋白，有成套的層 析柱存在于試劑盒中，省略了制備上述特定層析柱的步驟，更進(jìn)一步節(jié)省了純化的時(shí)間。
[0017] 本發(fā)明的純化方法相對于現(xiàn)有技術(shù)中的純化方法具有如下優(yōu)勢：1、提高酶切效 率，降低酶反應(yīng)時(shí)間，酶可以回收利用;2、酶經(jīng)過固定化，不會(huì)對后續(xù)工藝造成污染，無需增 加去除殘余酶步驟;3;酶切體系和串聯(lián)的層析柱平衡條件相同，減少了溶液種類和用量;4、 酶切后的柱層析采用穿透模式，目的蛋白直接從柱上流穿，整個(gè)純化工藝簡單緊湊。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明的示意性流程圖；
[0019] 圖2為示例性酶與介質(zhì)偶聯(lián)的化學(xué)方程式；
[0020] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中酶切效率定量測量的結(jié)果，測定了實(shí)施例1的方法中不同 流速的酶切效果圖，其中各泳道說明如下:pre:酶切前；l、0.5ml/min流速柱上酶切，保留時(shí) 間lOmin; 2、lml/min流速柱上酶切，保留時(shí)間5min; 3、2ml/min流速柱上酶切，保留時(shí)間 2.5min;4、5ml/min流速柱上酶切，保留時(shí)間lmin;
[0021 ]圖4為實(shí)施例1中重復(fù)酶切效果圖，其中各泳道說明如下:pre:酶切前；1、酶切第一 次;2、酶切第2次;3、酶切第3次；
[0022] 圖5為實(shí)施例2中不同酶切時(shí)間的腸激酶酶切效果圖，各泳道說明如下：1、融合蛋 白、2、酶切時(shí)間1分鐘;3、酶切時(shí)間12分鐘;4、酶切時(shí)間10分鐘;5、酶切時(shí)間2分鐘;6、酶切時(shí) 間4分鐘;7、酶切時(shí)間6分鐘;8、酶切時(shí)間8分鐘；
[0023] 圖6為根據(jù)實(shí)施例3的凝血酶切柱和精純Q柱串聯(lián)純化后樣品的電泳圖；
[0024] 圖7為根據(jù)實(shí)施例4的腸激酶切柱和Ni柱串聯(lián)酶切純化效果圖，其中各泳道分別 為：1、分子量標(biāo)記;2、Ni洗脫雜峰;3、Ni柱穿透的目的蛋白l;4、Ni柱穿透的目的蛋白2;各條 帶成分:a、剩余的融合蛋白；b、GH目的蛋白；c、融合頭蛋白；
[0025] 圖8為PTH融合蛋白常規(guī)純化工藝和固定化酶切與陰離子串聯(lián)純化工藝流程圖對 比。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 為了更詳細(xì)地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，下面通過【具體實(shí)施方式】示例性說明本發(fā) 明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，這些實(shí)施方式僅僅為說明本發(fā)明的實(shí)施，并不構(gòu)成對本發(fā)明的 保護(hù)范圍的限定。
[0027] 在蛋白質(zhì)工程化表達(dá)的現(xiàn)有技術(shù)中，能夠直接表達(dá)出目的蛋白，而不帶有其他雜 質(zhì)的情況很少，很多情況下通常是先表達(dá)出融合蛋白，然后通過酶切將融合蛋白上的非目 的蛋白部分酶切掉，再通過純化步驟得到目的蛋白。由于步驟繁瑣，不僅耗