腸桿菌的實驗結(jié)果如圖1所示，過氧化氫誘導使 得大腸桿菌處于氧化應激狀態(tài)，表現(xiàn)為出現(xiàn)短暫生長休眠期，以及生長緩慢。從圖中可以看 出，不同過氧化氫的濃度對大腸桿菌的生長有不同影響。
[0040] 和對照相比，25mM過氧化氫實驗組的細菌在0. 5h內(nèi)短暫休眠，然后開始緩慢增 長；50mM的細菌在lh內(nèi)短暫休眠，后緩慢增長；75mM組的細菌則在前2h內(nèi)休眠，后開始增 長，在3h時增長速率開始恢復；而100mM的細菌則在4h內(nèi)都未出現(xiàn)增長勢頭。如上所述， 我們選擇75mM為氧化應激誘發(fā)劑過氧化氫的實驗濃度，3h為測定細菌生長情況時的檢測 時間。
[0041] 實施例2阿魏酸對過氧化氫損傷大腸桿菌模型的保護作用
[0042] 1、實驗材料
[0043] 大腸桿菌CMCC(B) 44102,購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，廣州市蘿崗區(qū)廣州 開發(fā)區(qū)科學城神舟路788號；
[0044] 過氧化氫（30% H202,分析純，天津市東區(qū)紅巖試劑廠）；
[0045] 阿魏酸（Ferulic Acid)，3-甲氧基-4-羥基肉桂酸。
[0046] 2、實驗方法
[0047] 移取對數(shù)生長期的大腸桿菌CMCC (B) 44102,用LB培養(yǎng)基稀釋至0D6。。值約為0. 3， 于多孔板中加入阿魏酸與大腸桿菌在室溫靜置培養(yǎng)30min。所用阿魏酸用乙醇溶液配制，所 配的阿魏酸濃度梯度為：40 μ M、20 μ M、10 μ M、5 μ M。
[0048] 然后加入過氧化氫，誘導氧化應激。每孔加樣體積為200 μ L，過氧化氫的濃度為 75mM。用塑料膜包好多孔板，置于搖床（轉(zhuǎn)速為每分鐘160轉(zhuǎn)，溫度為37°C )中反應3小時 后，使用酶標儀測600nm波長處的0D值。存活率（％) = (0Dgw/0DPJ!WM)X100。
[0049] 3、實驗結(jié)果
[0050] 表1阿魏酸對過氧化氫損傷大腸桿菌的保護作用
[0051]
[0052] 通過該驗證實驗可以看出（結(jié)果如表υ，阿魏酸可以抑制過氧化氫對大腸桿菌的 氧化應激損傷，且抑制作用與濃度呈正相關性。并結(jié)合陰性對照實驗表明：阿魏酸在該實驗 條件下，對大腸桿菌的生長無任何影響。因此，說明可以利用該模型，通過測定物質(zhì)對大腸 桿菌生長的保護作用，來反映物質(zhì)的抗氧化能力。
[0053] 實施例3肉桂酸類化合物對過氧化氫損傷大腸桿菌模型的保護作用
[0054] 1、實驗材料
[0055] 菌株：
[0056] 大腸桿菌CMCC (Β) 44102 (甘肅省蘭州市食品藥品檢驗所提供）；
[0057] 供試樣品：
[0058] (1)咖啡酸：用冷乙醇溶液配制，所配的咖啡酸濃度梯度為：20 μ Μ、10 μ Μ ;
[0059] (2)阿魏酸：用乙醇溶液配制，所配的阿魏酸濃度梯度為：20 μ Μ、10 μ Μ ;
[0060] (3)對羥基肉桂酸：用生理鹽水配制，所配的對羥基肉桂酸濃度梯度為：20 μ Μ、 ΙΟμΜ ；
[0061] (4)肉桂酸：用乙醇溶液配制，所配的肉桂酸濃度梯度為：20 μ Μ、10 μ Μ。
[0062] 圖2為各供試樣品即肉桂酸類化合物的結(jié)構(gòu)式。
[0063] 2、實驗方法
[0064] 移取對數(shù)生長期的大腸桿菌CMCC (Β) 44102,用LB培養(yǎng)基稀釋至0D6。。值約為0. 3， 于多孔板中加入供試樣品與細胞在室溫靜置培養(yǎng)30min后。
[0065] 加入過氧化氫，誘導氧化應激。每孔加樣體積為200 μ L，過氧化氫的濃度75mM/L， 供試品濃度為：20 μ M/L和10 μ M/L。用塑料膜包好多孔板，置于搖床（轉(zhuǎn)速為每分鐘160 轉(zhuǎn)，溫度為37°C )中反應3小時后，使用酶標儀測600nm波長處的0D值。
[0066] 3、實驗結(jié)果
[0067] 表2肉桂酸類化合物對過氧化氫損傷大腸桿菌的保護作用
[0068]
[0069] 通過該驗證實驗可以看出（結(jié)果如表
2)，肉桂酸類化合物對過氧化氫損傷大腸桿 菌具有保護作用，且保護作用與濃度呈正相關性。并結(jié)合陰性對照實驗表明：供試品在該實 驗條件下，對大腸桿菌的生長無任何影響。比較四種具有相同肉桂酸母核，但是苯環(huán)取代不 同的化合物，可以得出抗氧化活性咖啡酸>阿魏酸>對羥基肉桂酸> 肉桂酸，與文獻報道 一致。因此，可以證實可以利用該模型，通過測定物質(zhì)對大腸桿菌生長的保護作用，來反映 物質(zhì)的抗氧化能力，并且可以利用該模型研究抗氧化活性與結(jié)構(gòu)之間的關系。
[0070] 由以上實驗結(jié)果證明，用大腸桿菌為模式生物建立的此方法可以用于供試樣品抗 氧化活性的評價，可以利用該模型，通過測定化合物對大腸桿菌生長的保護作用，來反映化 合物的抗氧化能力。
【主權(quán)項】
1. 一種測定物質(zhì)抗氧化活性的方法，其特征在于，該方法為：以大腸桿菌為模型，供試 樣品預先與大腸桿菌培養(yǎng)，然后加入氧化劑，繼續(xù)培養(yǎng)，采用光電比濁法，測定細菌生長情 況，供試樣品的抗氧化活性與供試樣品對細菌氧化應激的保護作用呈正相關性，可采用細 菌存活率來反映供試樣品抗氧化活性的大小，計算公式如下： 存活率（％ )=(藥物組0D/陰性對照組OD)X100%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定物質(zhì)抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的大腸 桿菌為：處于對數(shù)期的大腸桿菌。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定物質(zhì)抗氧化活性的方法，其特征在于，所述大腸桿 菌為：標準菌株CMCC(B)44102。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定物質(zhì)抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的氧化 劑為過氧化氫，過氧化氫的實驗濃度為75mM。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定物質(zhì)抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的光電 比濁法檢測OD時采用的波長為600nm。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定物質(zhì)抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的采用 光電比濁法測定細菌生長情況時的檢測時間為供試樣品預先與大腸桿菌培養(yǎng)3h。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定物質(zhì)抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的供試 樣品為水溶性物質(zhì)、或脂溶性物質(zhì)。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種測定物質(zhì)抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的水溶 性物質(zhì)在檢測前溶解于生理鹽水，脂溶性物質(zhì)在檢測前溶解于二甲基亞砜或者乙醇。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的一種測定物質(zhì)抗氧化活性的方法在藥品、食品及其 保健品抗氧化活性測定方面的應用。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的一種測定物質(zhì)抗氧化活性的方法在研究具有抗氧 化活性藥物的構(gòu)效關系方面的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定物質(zhì)抗氧化活性的方法，及其該抗氧化活性測定方法在藥品、食品及其保健品研究方面的應用，屬于藥品、食品及其保健品研究領域。該方法采用大腸桿菌標準菌株為實驗模型，以過氧化氫為自由基引發(fā)劑，處理對數(shù)生長期的大腸桿菌，使之處于氧化應激狀態(tài)。外源性引入抗氧化劑，驗證抗氧化劑對細菌氧化應激的保護作用。本發(fā)明在操作上簡單易行，對設備要求不高，成本低廉，具有很高的應用價值。
【IPC分類】C12R1/19, C12Q1/04
【公開號】CN105483203
【申請?zhí)枴緾N201410526061
【發(fā)明人】李紅玉, 馬曉燕, 鄭麗芳, 包艷芳
【申請人】蘭州大學
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2014年10月7日