9個(gè)分類單元的陽(yáng)性概率悉數(shù)列出，所以以分類單元中的Escherichia coli、 Citrobacter freundii、Enterobacter cloacae三種菌與其生化實(shí)驗(yàn)A、生化實(shí)驗(yàn)B、生化實(shí) 驗(yàn)C舉例來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。
[0048] 待測(cè)菌A生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果和Escherichia coli、Citrobacter freundii、 Enterobacter cloacae三種菌生化陽(yáng)性概率結(jié)果如表1所示：
[0049] 表1生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與陽(yáng)性概率
[0050]
[00511 生化實(shí)驗(yàn)A、生化實(shí)驗(yàn)B和生化實(shí)驗(yàn)C是屬于上述24種生化實(shí)驗(yàn)中的三種。
[0052]根據(jù)待測(cè)菌A的生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，三個(gè)生化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分別為+、_、+，因此按照前面 所述的計(jì)算方法，Escherichia coli的總出現(xiàn)頻率=98 X (100-1 ) X 90 = 873180; Citrobacter freundii的總出現(xiàn)頻率= 33X (100-78) X l = 726;Enterobacter cloacae的 總出現(xiàn)頻率=50 X (100-100) X99 = 50 X 1 X99 = 4950;多項(xiàng)總出現(xiàn)頻率= 873180+726+ 4950 = 878856;Escherichia coli的鑒定百分?jǐn)?shù)= 873180+ 878856 X 100 = 99.35; Citrobacter freundii的鑒定百分?jǐn)?shù)= 726+ 878856 X 100 = 0 · 08;Enterobacter cloacae 的鑒定百分?jǐn)?shù)= 4950 + 878856X100 = 0.56。由于本發(fā)明包括的分類單元為159個(gè)及生化反 應(yīng)為24個(gè)，每鑒定一株菌需要對(duì)159個(gè)分類單元都進(jìn)行鑒定百分?jǐn)?shù)的計(jì)算，人工計(jì)算工作量 大，工作進(jìn)程將會(huì)受到嚴(yán)重的影響，因此，計(jì)算過(guò)程在相應(yīng)的配套軟件進(jìn)行。
[0053] 3結(jié)果評(píng)價(jià)和鑒定
[0054]在159個(gè)分類單元中，按照鑒定百分?jǐn)?shù)大小排序，列出前五個(gè)分類單元，按照結(jié)果 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。
[0055]如本實(shí)施列中，按照鑒定百分?jǐn)?shù)大小重新排列為：Escherichia col i、 Enterobacter cloacae、Citrobacter freundii。
[0056] 待測(cè)菌A鑒定結(jié)果為:大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。
[0057] 不一致的生化實(shí)驗(yàn)如表2所示：
[0058] 表2不一致的生化實(shí)驗(yàn)
[0059]
[0060] 4食源性致病菌腸桿科菌種的數(shù)值快速鑒定方法置信度的驗(yàn)證
[0061] 實(shí)驗(yàn)菌株包括40株腸桿菌科標(biāo)準(zhǔn)菌株，實(shí)際樣品中的菌株來(lái)源于全國(guó)范圍內(nèi)對(duì)肉 與肉制品、水產(chǎn)品、乳制品、蔬菜、熟食、速凍食品、食用菌、共7大類食品的污染調(diào)查以及珠 江水中分離出的腸桿科菌種。對(duì)這些腸桿科菌種按照本發(fā)明的腸桿菌科的數(shù)值快速鑒定方 法進(jìn)行鑒定，以及以同類商品化產(chǎn)品法國(guó)梅里埃公司API20E與英國(guó)Microgen公司的MID GNA和或GNB，以特異性基因的分子生物學(xué)PCR方法、16S rDNA基因測(cè)序法加以佐證。在40株 標(biāo)準(zhǔn)菌株及1605株分離株中，各方法的鑒定結(jié)果如表3，4,5，6:
[0062] 可確定的鑒定結(jié)果包括極好、很好、好及可接受的鑒定結(jié)果，不確定的鑒定結(jié)果包 括可疑、不可接受的鑒定結(jié)果。一致的鑒定結(jié)果與不一致的鑒定結(jié)果是在可確定的結(jié)果基 礎(chǔ)上分析的，若本發(fā)明與對(duì)照結(jié)果鑒定結(jié)果一致，則為一致的鑒定結(jié)果，反之亦然。較優(yōu)的 鑒定結(jié)果為本發(fā)明鑒定結(jié)果優(yōu)于對(duì)照;較差的鑒定結(jié)果為本發(fā)明的結(jié)果差于對(duì)照。不一致 的鑒定結(jié)果分為本發(fā)明與對(duì)照結(jié)果為確定的鑒定結(jié)果;或本發(fā)明結(jié)果為可確定，而對(duì)照為 不可確定的鑒定結(jié)果;或本發(fā)明結(jié)果不可確定，而對(duì)照為可確定的鑒定結(jié)果。都不理想的鑒 定結(jié)果則是本發(fā)明與對(duì)照都為不可確定的鑒定結(jié)果。
[0063] 表3本發(fā)明的腸桿菌科的數(shù)值快速鑒定方法與MID方法鑒定結(jié)果
[0064]
[0065] ~表4本發(fā)明的腸桿菌科的k值快速鑒定方法與MID GWV方法鑒定結(jié)果的區(qū)別 '
[0066]
[0067] ~表5本發(fā)明的腸桿菌科的數(shù)值快速鑒定方法與API 20E方法鑒定結(jié)果 '
[0068]

[0069] 表6本發(fā)明的腸桿菌科的數(shù)值快速鑒定方法與API 20E方法鑒定結(jié)果的區(qū)別
[0070]
[0071]~本發(fā)明在對(duì)無(wú)丙二酸鹽檸檬酸菌與克氏檸檬酸菌的鑒定上能將兩者很好的區(qū)分/ 而API20E的結(jié)果只能是兩者的結(jié)果。結(jié)果如表7所示：
[0072]
[0073] 本發(fā)明對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森的鑒定能鑒定到生物型的水平，本發(fā)明對(duì)128株小腸 結(jié)腸炎耶爾森鑒定到生物1A型，而API 20E與MID G NA+GNB只能鑒定到種的水平。
[0074] 40株標(biāo)準(zhǔn)菌株，本發(fā)明與對(duì)照(API 20E)都能得到很好的鑒定結(jié)果。對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株中 為大腸埃希氏菌(544株）、沙門氏菌屬（308株)和坂崎腸桿菌（154株)進(jìn)行了以特異性基因 的分子生物學(xué)PCR方法驗(yàn)證。各菌株P(guān)CR都能擴(kuò)增出正確的特異性條帶，而本發(fā)明鑒定的大 腸埃希氏菌、沙門氏菌屬和坂崎腸桿菌分別為527株、308株、154株;對(duì)照鑒定的大腸埃希氏 菌、沙門氏菌屬和坂崎腸桿菌分別為519株、308株、154株。本發(fā)明與對(duì)照鑒定的菌株數(shù)無(wú)明 顯差異性，但是本發(fā)明對(duì)沙門氏菌屬鑒定中有152株鑒定到亞屬-腸道沙門氏菌I，而API 20E只能鑒定到沙門菌屬，通過(guò)血清學(xué)鑒定，證實(shí)152株沙門氏菌確實(shí)為腸道沙門氏菌I;本 發(fā)明在對(duì)阪崎腸桿菌鑒定時(shí)有47株的鑒定結(jié)果為好的鑒定結(jié)果，但是API 20E需要在增加 黃色素的基礎(chǔ)上才能得到好的鑒定結(jié)果，因此整體上本發(fā)明優(yōu)于對(duì)照API 20E。
[0075]對(duì)270株腸桿科菌（除大腸埃希氏菌、沙門氏菌屬和阪崎腸桿菌)進(jìn)行了 16S rDNA 基因測(cè)序法驗(yàn)證。結(jié)合16S鑒定結(jié)果，本發(fā)明與16S結(jié)果一致的分離株為255株，有15株的結(jié) 果不一致;API 20E與16S鑒定結(jié)果一致的分離株為210株，有60株的鑒定結(jié)果不一致;其中 有10株本發(fā)明與API 20E與16S的結(jié)果均不一致。因此從16S鑒定結(jié)果看，本發(fā)明的鑒定結(jié)果 優(yōu)于API 20E。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種食源性致病菌腸桿科菌種的數(shù)值快速鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟： a、 確定腸桿科菌的種類及其至少24個(gè)生化實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)陽(yáng)性的概率，所述的24個(gè)生化實(shí)驗(yàn) 為:苯丙氨酸脫氨、木糖、棉子糖、吲哚、蔗糖、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、乳糖、ONPG、尿酶、檸檬酸鹽、麥 芽糖、賴氨酸脫羧酶、丙二酸鹽、山梨醇、衛(wèi)矛醇、阿拉伯糖、蜜二糖、鼠李糖、七葉苷、MR、 H2S、海藻糖、纖維二糖、氧化酶； b、 選擇步驟a中的24個(gè)生化實(shí)驗(yàn)作為數(shù)值法中所需要的生化反應(yīng)： c、 建立腸桿科菌的數(shù)據(jù)庫(kù)，確定數(shù)值法中計(jì)算方法:根據(jù)選擇的分類單元與生化實(shí)驗(yàn) 的陽(yáng)性概率，形成一個(gè)概率矩陣； 按照細(xì)菌概率鑒定理論確定每一個(gè)分類單元的總出現(xiàn)頻率、多項(xiàng)總發(fā)生頻率、鑒定百 分?jǐn)?shù)的計(jì)算方法，具體計(jì)算公式如下： 每一個(gè)分類單元的總出現(xiàn)頻率等于該分類單元對(duì)應(yīng)的每個(gè)生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率的乘 積； 多項(xiàng)總發(fā)生頻率等于每一個(gè)分類單元的總出現(xiàn)頻率的總和； 鑒定百分?jǐn)?shù)等于每一個(gè)分類單元總出現(xiàn)頻率除以多項(xiàng)總發(fā)生頻率再乘以100,全體鑒 定百分?jǐn)?shù)之和應(yīng)等于100; d、 待測(cè)菌株純培養(yǎng)后，進(jìn)行革蘭氏染色，氧化酶，OF試驗(yàn)，選擇革蘭氏染色為陰性、氧化 酶陰性，OF為發(fā)酵型的菌株進(jìn)行步驟a的24種生化實(shí)驗(yàn)； e、 獲得待測(cè)菌株的24種生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，根據(jù)生化反應(yīng)的陰、陽(yáng)、未知值，按照計(jì)算方 法對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中所有分類單元進(jìn)行計(jì)算，首先將生化實(shí)驗(yàn)值轉(zhuǎn)換成概率值，即實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng) 性則就是對(duì)應(yīng)生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率值;若為陰性則100減去生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率值，上述結(jié) 果若是〇或100,則用近似值1或99代替，再按照步驟c的計(jì)算方法計(jì)算每一個(gè)分類單元的總 出現(xiàn)頻率、多項(xiàng)總發(fā)生頻率、鑒定百分?jǐn)?shù)、若某項(xiàng)生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果為未知或模糊不清，則該生 化實(shí)驗(yàn)項(xiàng)不參與計(jì)算； f、 根據(jù)計(jì)算結(jié)果，對(duì)待測(cè)菌株鑒定結(jié)果進(jìn)行判定:根據(jù)鑒定百分?jǐn)?shù)的大小進(jìn)行排序，鑒 定百分?jǐn)?shù)最高相對(duì)應(yīng)的菌株即為待測(cè)菌株所屬的分類單元。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食源性致病菌腸桿科菌種的數(shù)值快速鑒定方法，其特征在于， 對(duì)待測(cè)菌株的鑒定都給出不一致的生化實(shí)驗(yàn)并單列出來(lái)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食源性致病菌腸桿科菌種的數(shù)值快速鑒定方法，其特征在于， 在結(jié)果顯示中，對(duì)分類單元給出中文，拉丁文對(duì)照。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種食源性腸桿科菌種的數(shù)值快速鑒定方法。它包括腸桿科菌種類與陽(yáng)性概率的確認(rèn)；數(shù)值法中選擇的生化反應(yīng)；建立腸桿科菌的數(shù)據(jù)庫(kù)，確定數(shù)值法中計(jì)算方法；待測(cè)菌的檢測(cè)與鑒別。本發(fā)明可以對(duì)純培養(yǎng)物預(yù)先進(jìn)行革蘭氏染色，氧化酶，OF試驗(yàn)，然后通過(guò)本發(fā)明的食源性致病菌腸桿科菌種的數(shù)值快速鑒定方法，一般對(duì)腸桿科菌能夠得到較理想的鑒定結(jié)果。本發(fā)明可以鑒定出腸桿菌科31屬139個(gè)菌種與8個(gè)未分類的群，共159個(gè)分類單元，并且可以將小腸結(jié)腸炎耶爾森菌氏菌鑒定至6種生化型。同時(shí)鑒定的菌種數(shù)量和準(zhǔn)確性均可大大高于市場(chǎng)現(xiàn)有國(guó)際上公認(rèn)的兩個(gè)同類鑒定方法。
【IPC分類】C12R1/01, C12R1/19, C12Q1/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105483207
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510866404
【發(fā)明人】吳清平, 葉青華, 張菊梅, 蔡芷荷, 闕紹輝
【申請(qǐng)人】廣東省微生物研究所, 廣東環(huán)凱生物科技有限公司, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年4月13日
【申請(qǐng)日】2015年11月30日