一種結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及結(jié)核分枝桿菌的檢測，具體涉及一種結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起結(jié)核?。╰uberculosis)的 病原體，可侵犯人體全身各器官，其中以肺結(jié)核最為多見。結(jié)核病是全世界面臨的最大公共 衛(wèi)生問題，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球每年約有800萬新發(fā)結(jié)核病患者，并且至少有300萬人 死于該病。中國是世界結(jié)核病負(fù)擔(dān)最重的國家之一，并且發(fā)病速度下降非常緩慢，疫情主要 集中在經(jīng)濟相對不發(fā)達的西部地區(qū)以及農(nóng)村地區(qū)。
[0003] 作為呼吸道傳染性疾病，結(jié)核分枝桿菌主要通過空氣飛沫進行傳播。據(jù)文獻報道， 1名結(jié)核病患者能夠傳染10名以上的普通人感染結(jié)核，特別是近年來，在學(xué)生及流動人口等 人員相對密集的人群中，每年多次發(fā)生聚集性疫情。因此，如何快速并且準(zhǔn)確地對結(jié)核分枝 桿菌進行檢測，對于及時發(fā)現(xiàn)傳染源、及早開展有效地抗結(jié)核治療以及控制結(jié)核病在人群 中的傳播和蔓延具有重要意義。
[0004] 傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌檢測方法主要包括涂片和培養(yǎng)等細(xì)菌學(xué)檢測方法。涂片法雖 然檢測時間較短，然而靈敏度較低，通常要求待測樣本中結(jié)核分枝桿菌含量高于1000個/ mL，此外特異性較差，特別是無法區(qū)分樣本中結(jié)核分枝桿菌的存活狀態(tài)，因此易造成假陽 性;培養(yǎng)法的靈敏度和特異性較高于涂片法，其能區(qū)分標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的存活狀態(tài)，然 而由于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁較厚且生長周期較長，培養(yǎng)時間通常需要4-8周，因此不利于實 際的臨床應(yīng)用。
[0005] 目前，已有研究將多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌DNA的鑒定， 該方法主要針對的是樣本中核酸的存在與否以及拷貝數(shù)，其雖具有靈敏度高、快速等優(yōu) 點，然而無法區(qū)分樣本中的死菌和活菌這一缺陷導(dǎo)致檢測假陽性率較高，此外引物和探針 的設(shè)計對于檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和特性異至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒及其應(yīng)用，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的結(jié)核 分枝桿菌檢測方法靈敏度和特異性低、假陽性率高等技術(shù)缺陷。
[0007] 本發(fā)明提供一種結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，包括：
[0008] 上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0009] 下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；
[0010]探針，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，并且在探針的5'端標(biāo)記焚光基團，在探 針的3'端標(biāo)記淬滅基團。
[0011]在本發(fā)明中，所述熒光基團和淬滅基團可以為本領(lǐng)域的常規(guī)基團，例如所述熒光 基團可以為FAM，所述淬滅基團可以為MGB。
[0012]進一步地，所述上游引物、下游引物和探針可以常規(guī)濃度單獨存在試劑盒中，例如 上游引物的濃度可以為5_20μΜ，下游引物的濃度可以為5-20μΜ，探針的濃度可以為1 -1 ΟμΜ。 [0013]本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒還可以包括光敏DNA染料;進一步地，光敏DNA 染料可以5_20mg/mL的濃度單獨存在于試劑盒中。光敏DNA染料是對DNA具有高度親和力的 光敏染料，例如可以為疊氮溴化乙錠(EMA)、疊氮溴化丙啶(PMA)等，其能選擇性地進入細(xì)胞 壁和細(xì)胞膜受損的死細(xì)胞中，通過光活化反應(yīng)(例如光照處理)與死細(xì)胞中的DNA共價結(jié)合， 從而阻斷死細(xì)胞DNA后續(xù)的PCR擴增;此外，由于活細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜相對完整，該類染 料無法進入活細(xì)胞中，從而不會影響活細(xì)胞DNA后續(xù)的PCR擴增。在本發(fā)明的試劑盒中設(shè)置 上述光敏DNA染料有利于提高結(jié)核分枝桿菌檢測的特異性和準(zhǔn)確性，避免造成假陽性。
[0014] 本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒還可以包括實施熒光定量PCR所必要的其它試 劑，例如稀釋液、裂解液、PCR混合液等，其均可以為本領(lǐng)域的常規(guī)試劑。其中，稀釋液用于進 行稀釋，其可以為PBS緩沖液等;裂解液用于提取樣本DNA，其可以為本領(lǐng)域常規(guī)提取方法所 用的裂解液，包括但不限于CTAB法、酚/氯仿法、Che 1 ex 100法等;PCR混合液用于實施熒光 定量PCR，其可以包括本領(lǐng)域常規(guī)的PCR緩沖液、DNA聚合酶、dNTPs、鎂離子等。
[0015] 進一步地，本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒還可以包括結(jié)核分枝桿菌陽性對照 液和結(jié)核分枝桿菌陰性對照液中的一種或多種。其中，結(jié)核分枝桿菌陽性對照液可以為活 的結(jié)核分枝桿菌，例如結(jié)核分枝桿菌H37Rv，其濃度可為10 2-104個/mL;結(jié)核分枝桿菌陰性對 照液可以為滅活的結(jié)核分枝桿菌或者活的非結(jié)核分枝桿菌，非結(jié)核分枝桿菌例如可以為恥 垢分枝桿菌(菌株編號為ATCC19420)，其濃度可為10 2-104個/mL。上述陽性對照液和陰性對 照液用于在結(jié)核分枝桿菌檢測過程中作為內(nèi)參，從而避免因人為等因素造成的檢測誤差， 提尚檢測的準(zhǔn)確性。
[0016] 本發(fā)明還提供一種上述任一所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒在結(jié)核分枝桿菌檢 測中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明還提供一種結(jié)核分枝桿菌檢測方法，采用上述任一所述的結(jié)核分枝桿菌檢 測試劑盒進行，所述方法包括如下步驟：
[0018] 1)對待測樣本進行液化處理，制得液化樣本；
[0019] 2)向所述液化樣本中加入光敏DNA染料，避光孵育后進行光照處理，制得處理樣 本；
[0020] 3)提取所述處理樣本的DNA，并以所述DNA為模板進行熒光定量PCR，得到Ct值;若 Ct值2 36則為陰性，若Ct值〈36則為陽性。
[0021] 在本發(fā)明中，可以采用常規(guī)方法進行所述液化處理。在一實施方式中，步驟1)可以 包括：向待測樣本中加入質(zhì)量含量為4%的NaOH溶液，震蕩后靜置，隨后加入緩沖液并離心， 棄上清液后加入緩沖液重懸沉淀，制得液化樣本。
[0022] 進一步地，步驟2)可以包括：向所述液化樣本中加入疊氮溴化丙錠至終濃度為10-20yg/mL，置于2-6°C暗處理l_3h，隨后避光孵育15-25min，再光照處理15-25min，制得處理 樣本。
[0023] 在本發(fā)明中，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)方法進行所述熒光定量PCR，例如反應(yīng)體系可以 為:所述探針2yL，所述上游引物2yL，所述下游引物2yL，所述DNA 2yL，無 RNA酶的水2yL，PCR 混合液10yL;反應(yīng)程序可以為:95°C預(yù)變性2min，95°C變性5秒，60°C退火20秒，共40個循環(huán)。
[0024] 進一步地，所述方法還包括同時以結(jié)核分枝桿菌陽性對照液和結(jié)核分枝桿菌陰性 對照液作為內(nèi)參。
[0025] 本發(fā)明的實施，至少具有以下優(yōu)勢：
[0026] 1、本發(fā)明提供的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒操作簡單，并且能夠快速地對結(jié)核分枝 桿菌進行檢測，特別是特定設(shè)計的引物和探針不僅在不同結(jié)核分枝桿菌菌株間同源性高， 并且在結(jié)核分枝桿菌基因組中具有較高的拷貝數(shù)，此外與其他非結(jié)核分枝桿菌微生物的同 源性較低，特異性好。
[0027] 2、本發(fā)明提供的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒可包括光敏DNA染料，因此有利于區(qū)別 待測樣本中的死菌和活菌，從而有效避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn);此外，該試劑盒還可包括結(jié)核 分枝桿菌陽性對照液和結(jié)核分枝桿菌陰性對照液，其作為內(nèi)參進一步保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn) 確性。
[0028] 3、本發(fā)明提供的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒對檢測樣本的要求低，靈敏度高，檢測 速度快，特異性和準(zhǔn)確性高，適應(yīng)性廣泛，特別適用于對臨床標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的早期檢 測 。
【具體實施方式】
[0029]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明的實施例，對本 發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實 施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造 性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0030] 實施例1
[0031 ]本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，包括：
[0032] 上游引物:GGTCAGCACGATTCGGAGTG(SEQ ID N0:1);
[0033] 下游引物：CGGATTCTTCGGTCGTGGTC(SEQ ID N0:2);
[0034] 探針：5'-FAM-CGTCTACTTGGTGTTGGCTGCG-MGB-3'（SEQ ID N0:3)。
[0035] 本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒中，上游引物的濃度為5μΜ;下游引物的濃度為 5μΜ，探針的濃度為1 μΜ。
[0036]上述結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒進一步包括疊氮溴化丙錠;其濃度為10mg/mL。
[0037] 上述結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒進一步包括結(jié)核分枝桿菌陽性對照液和結(jié)核分枝 桿菌陰性對照液;其中：結(jié)核分枝桿菌陽性對照液為結(jié)核分枝桿菌H37Rv，其濃度為1 X 102 個/mL;結(jié)核分枝桿菌陰性對照液為恥垢分枝桿菌（菌株編號為ATCC19420)，其濃度為IX l〇MVmL〇
[0038] 上述結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒進一步包括稀釋液、裂解液、PCR混合液等其它必要 試劑。其中，PCR混合液包括PCR緩沖液、DNA聚合酶、dNTPs和鎂離子;DNA聚合酶用量為5U/ uL，dNTPs的終濃度為0.5mmol/L，鎂離子的終濃度為2. Ommol/L。
[0039] 上述各組分單獨設(shè)于結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒中。
[0040] 實施例2
[0041 ] 1、樣品制備
[0042]利用改良羅氏培養(yǎng)基對結(jié)核分枝桿菌H37Rv進行培養(yǎng)，培養(yǎng)后刮取菌落于磨菌瓶， 并將其制成濃度為1 x 1〇8個/mL的活菌液。
[0043]將上述活菌液分成兩份，將其中一份活菌液梯度稀釋成濃度為1 X 102個/mL的菌 液，記作樣品1;將另一份活菌液置于沸水中加熱30分鐘滅活