Bcr基因和abl基因檢測探針及其制備方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明屬于生物技術(shù)，特別是涉及BCR基因和ABL基因檢測探針及其制備方法和試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myelogenous leukemia,CML)是一種起源于造血干 細(xì)胞的克隆性骨髓增殖性腫瘤，主要累及粒細(xì)胞系，表現(xiàn)為持續(xù)、進(jìn)行性外周血白細(xì)胞數(shù)量 增加。CML起病緩慢，初期癥狀不明顯。其自然病程是由慢性期進(jìn)展為加速期，最后發(fā)展為急 變期，急變后患者常在3~5個(gè)月內(nèi)死亡。
[0003] 90%以上患者白血病細(xì)胞中有恒定的、特征性的Ph染色體及其分子標(biāo)志BCR/ABL 融合基因。Ph染色體絕大多數(shù)為以9;22)^34^11)典型易位，少數(shù)患者有變異易位，包括22 號染色體與非9號染色體間簡單變異易位，3條或更多條染色體間的復(fù)雜易位(隱匿易位）。 Ph染色體存在于CML的整個(gè)病程中，治療緩解后，仍持續(xù)存在，因此采用骨髓移植，消除Ph陽 性克隆，才能達(dá)到最終治愈。
[0004] 因此，通過對初診患者進(jìn)行BCR/ABL檢測，可以診斷CML，進(jìn)行酪氨酸激酶抑制劑受 益人群篩查。
[0005] 焚光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是20世紀(jì)80年代末 期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)。目前這 項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、 人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域。FISH的基本原理是用已知的標(biāo) 記核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可 被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以 探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位 雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因 此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。
[0006] 雜交所用的探針大致可以分類三類：1)染色體特異重復(fù)序列探針，例如α衛(wèi)星、衛(wèi) 星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復(fù)序列，與靶位結(jié)合緊密，雜交信號強(qiáng)， 易于檢測；2)全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區(qū)段上 極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得;3) 特異性位置探針，由一個(gè)或幾個(gè)克隆序列組成。
[0007]探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記 DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測，同時(shí)還可以利用親和 素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號進(jìn)行放大，從而可以檢測500bp左右的片段。而直接 標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針 時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測時(shí)步驟簡單，臨床使用方便。
[0008]而目前對于BCR/ABL基因 FISH檢測，還缺少特異性高的檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的之一是提供一種BCR基因和ABL基因檢測探針及其制備方法，所制備 的探針可用于檢測BCR基因和ABL基因狀態(tài)，即檢測BCR基因和ABL基因檢測，檢測的融合類 型包括典型易位、變異易位和隱匿易位，具有很好的特異性。
[0010] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0011] -種BCR基因和ABL基因檢測探針的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)選取針對 BCR 基因的 BAC 克隆為 RP11-1026A5、RP11-165G5、CTD-2079I4 中至少 一種，和選取BAC克隆為CTD-2302P22、CTD-2037J11、CTD-2509L4中的至少一種；和選取針對 ABL 基因的 BAC 克隆為 01)-20371^19、1^11-21610、01)-2526620中至少一種；
[0013] (2)對克隆分別提取質(zhì)粒，得到質(zhì)粒DNA，定量；
[0014] (3)用熒光素標(biāo)記質(zhì)粒DNA，針對BCR基因和針對ABL基因的檢測探針標(biāo)記的熒光素 的顏色不相同，且針對BCR基因中，來源于BAC克隆RP11-1026A5、RP11-165G5、CTD-2079I4的 探針與來源于BAC克隆CTD-2302P22、CTD-2037J11、CTD-2509L4的探針的熒光素的顏色不相 同，即得。
[0015] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，針對ABL基因的所述BAC克隆為CTD-2037L19、RP11-21G10、 和CTD-2526G20。
[0016] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，針對BCR基因的BAC克隆為RP11-1026A5、RP11-165G5、和 CTD-2079I4,和 BAC 克隆為 CTD-2302P22、CTD-2037JlUPCTD-2509L4。
[0017] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)記熒光素選擇本領(lǐng)域已知的熒光染料，優(yōu)選地，熒光素為 AlexaF]U〇r?488、FITC、AlexaFlu〇l'(§)555、Rhodamine、Texas Red、pacific blue?、DEAC〇
[0018] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，基因探針的標(biāo)記可以采用現(xiàn)有技術(shù)中的方法將相應(yīng)熒光素 標(biāo)記至雙鏈核酸上，所述方法包括但不限于：隨機(jī)引物法、切口平移等，標(biāo)記基因探針可以 使用市售的缺口平移標(biāo)記試劑盒和隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒，優(yōu)選abbott和Roche公司的Nick Translation Kit。本發(fā)明步驟(3)優(yōu)選采用隨機(jī)引物法、切口平移法對質(zhì)粒DNA進(jìn)行焚光素 記 D
[0019] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述標(biāo)記的溫度為15°c-l8°C，標(biāo)記的時(shí)間為8-12小時(shí)。
[0020] 本發(fā)明的另一目的是提供一種BCR基因和ABL基因檢測試劑盒。
[0021] 實(shí)現(xiàn)該目的技術(shù)方案如下。
[0022] 一種BCR基因和ABL基因檢測試劑盒，包括有上述BCR基因和ABL基因檢測探針。 [0023] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，還包括有用于封閉重復(fù)序列的COT Human DNA，和DAPI復(fù)染 劑。
[0024]本發(fā)明具有以下有益效果：
[0025] 1.本發(fā)明通過篩選到最優(yōu)的BCR基因和ABL基因檢測探針及其組合，采用FISH (Fluorescence In-Situ Hybridization)方法實(shí)現(xiàn)對已知或未知類型的BCR/ABL融合基因 檢測;可實(shí)現(xiàn)對BCR斷裂類型的鑒定。
[0026] 2.通過本發(fā)明所述的檢測探針進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的信號計(jì)數(shù)、且結(jié)果重復(fù)性好;通過 FISH方法對BCR/ABL融合檢測，補(bǔ)充了臨床中BCR/ABL融合檢測的不足，有利于準(zhǔn)確確診 CML，提高患者生存率和總生存期。
[0027] 3.本發(fā)明優(yōu)選克隆檢測特異性好，靈敏度高。通過對大片段重排的直觀檢測，不易 遺漏復(fù)雜變異類型，對未知融合類型也有很好的鑒別性。
[0028] 4.通過本發(fā)明所述的BCR基因和ABL試劑盒，實(shí)現(xiàn)在腫瘤生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等領(lǐng) 域的應(yīng)用，有助綜合評價(jià)各分子標(biāo)志物，輔助臨床靶向治療用藥及治療方案選擇。
【附圖說明】
[0029]圖1A為是實(shí)施例1中ABL基因檢測探針序列的示意圖。
[0030]圖1B為是實(shí)施例1中BCR基因檢測探針序列的不意圖。
[0031 ]圖2為實(shí)施例1中人外周血培養(yǎng)細(xì)胞片BCR基因和ABL基因檢測探針FISH檢測結(jié)果 圖。
[0032] 圖3為實(shí)施例4中臨床骨髓樣本FISH檢測結(jié)果圖，結(jié)果顯示2R2GA，未見BCR/ABL融 合。
[0033] 圖4為實(shí)施例4中臨床骨髓樣本FISH檢測結(jié)果圖，結(jié)果顯示1R1GA/1RG1RA，發(fā)現(xiàn) BCR/ABL 融合。
[0034] 圖5為實(shí)施例4中臨床骨髓樣本FISH檢測結(jié)果圖，結(jié)果顯示1R1GA/1RG1RGA，BCR/ ABL基因融合，且為次要斷裂類型。
【具體實(shí)施方式】
[0035]為了便于理解本發(fā)明，下面將對本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。本發(fā)明可以以許多不 同的形式來實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對本 發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。
[0036 ]下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所 述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售 產(chǎn)品。
[0037]除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域 的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí) 施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語"和/或"包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列 項(xiàng)目的任意的和所有的組合。
[0038] 實(shí)施例1 BCR基因和ABL基因檢測探針的制備
[0039]所述ABL檢測探針(GSP ABL)的制備方法，包括以下步驟：
[0040]克隆篩選:挑選包含目的基因 ABL及兩端序列的克隆，如圖1A所示。
[0041] GSP ABL1包括第一探針、第二探針、第三探針、第四探針、第五探針，可以是其中的 一個(gè)、幾個(gè)，或者是多個(gè)組合。
[0042] 本實(shí)施例選擇5種探針的組合，具體如下表，其購買于Invitrogen RP11BAC及CTD BAC克隆庫。
[0043] ABL1 基因 chr9:133，589，268-133，763，062，173，795bp
[0044]

[0045]所述BCR檢測探針(GSP BCR)的制備方法，包括以下步驟：
[0046] 克隆篩選:挑選包含目的基因 BCR Μ-BCR位點(diǎn)外的兩端序列的克隆制備GSP BCR探 針，如圖1B所示。GSP BCR包括兩組探針，這兩組探針分別位于BCR主要斷裂點(diǎn)的3'端和5' 端。
[0047] BCR 基因 chr22:23，522，552-23，660，224，137，673bp
[0048]
[0051 ] (2)GSP BCR和GSPABL基因檢測探針制備：使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit， 按照說明書要求的操作方法對不同BAC克隆分別進(jìn)行超低拷貝質(zhì)粒DNA提取，通過測定 260nm和280nm處的吸光度對質(zhì)粒DNA定量;采用高壓滅菌的超純水稀釋為200ng/ul，采用 1.5ml的離心管分裝，最后將得到的對應(yīng)BCR基因或ABL基因的3種或5種相應(yīng)組合的質(zhì)粒DNA 混合，-20°C密封保存。
[0052] (3)通過切口平移方法對質(zhì)粒DNA混合物進(jìn)行熒光標(biāo)記，針對GSP BCR基因的組2探 針標(biāo)記的熒光素為green-dUTP，組3探針標(biāo)記的熒光素 Aqua-dUTP，針對GSP ABL基因每種探 針標(biāo)記的焚光素為:red-dUTP。采用abbott的Nick Translation Kit，按如下方案，嚴(yán)格避光 條件下在冰上配制PCR反應(yīng)體系。
[0053]
[0054] 配完后震蕩混勻，在16UC標(biāo)記10小時(shí)，再80UC孵育10分鐘滅活酶。取5ul使用2%瓊 脂糖凝膠做電泳，分別在50-500bp左右存在彌散的條帶。
[0055] 對標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀和濃縮，按如下方案在1.5ml離心管中依次加入醋酸鈉 和無水乙醇，避光、冰上配制：
[0056] 標(biāo)記產(chǎn)物 45ul
[0057] 醋酸鈉（3mol/L) 5ul
[0058] 無水乙醇 125ul
[0059] 混勻后置于-70°C冰箱中至少2小時(shí)，4°C13000rpm離心