一種鴨黃病毒的rt-lamp檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種鴨黃病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨黃病毒又名鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus)屬于黃病毒科 (Flaviviridae)，黃病毒屬(f lavivirus)。2010年江浙滬一帶爆發(fā)了一種以蛋鴨產(chǎn)蛋率下 降、生長(zhǎng)遲緩、減重、食欲減退、高熱及部分死亡為癥狀的疾病，從病鴨體內(nèi)分離到了致病病 毒，經(jīng)過(guò)基因序列比對(duì)，該病毒被認(rèn)為是屬于一個(gè)新的基因型，為T(mén)MUV組的黃病毒屬的病 毒。
[0003] 目前，鴨黃病毒檢測(cè)主要依賴病毒分離和分子生物學(xué)檢測(cè)。病毒分離是鴨黃病毒 的傳統(tǒng)檢測(cè)方法;分子生物學(xué)檢測(cè)方法有RT-PCR、套式RT-PCR、熒光定量RT-PCR等，這些方 法操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是日本學(xué)者Notomi于2000年發(fā)明的一種基因 恒溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)3對(duì)特異引物，利用一種鏈置換DNA 聚合酶在等溫條件(63 °C左右）保溫30-60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR相比， 該方法不需要電泳及紫外觀察等過(guò)程，且靈敏度、特異性都優(yōu)于PCR技術(shù)，而且不需要任何 專門(mén)的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本低。本發(fā)明擬利用LAMP技術(shù)，建立 一種靈敏特異，快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)鴨黃病毒的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確的檢測(cè)鴨黃病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005] 本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，采用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)是在核酸水平上的一 種檢測(cè)技術(shù)，具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明提供的試劑盒包括以下組分： 1) RT-LAMP反應(yīng)液：內(nèi)含濃度為8mmol/L MgS〇4,5.6mmol/L dNTP Mixture; 2) 引物混合液;檢測(cè)鴨黃病毒的引物組按照F3:B3:FIP:BIP:LF:LB為5nM:5nM:40 nM: 40 nM: 20nM: 20nM的比例混合； 其中所涉及的檢測(cè)引物序列為： 上游內(nèi)引物FIP序列： 5'- GCGGCATGTTTCAGCGACTGCATGGTTCCACGGAAGCG -3'， 下游內(nèi)引物BIP序列： 5'-AACGCCCAAAAGTCCCGTCTACGGGGTTCACATTCGAGTGTG -3'. 上游外引物F3序列： 5， -GCAGAAGGAAAACGTCCAGT -3， 下游外引物B3序列： 5 ' -CCCATGTCAACCCCAGATC -3 '， 上游環(huán)引物L(fēng)F序列 5 ' -GGCTGAATAATTGTGGTAGGTGCT -3 '， 下游環(huán)引物L(fēng)B序列 5' -ACCGCTGAGATGGAGGATTATG -3' 3) 酶混合物:濃度均為5U/yL的AMV反轉(zhuǎn)錄酶與8000U/mL的Bst DNA聚合酶按1:1比例混 勻分裝； 4) 目視熒光染料。
[0007] 5)DEPC水：內(nèi)含濃度為1%。的焦炭酸二乙酯。
[0008] 6)陰性對(duì)照：ddH20。
[0009] 7)陽(yáng)性對(duì)照:利用鴨黃病毒E基因構(gòu)建的假病毒顆粒。
[0010] 本發(fā)明提供的檢測(cè)方法具體步驟是： 采集禽類(lèi)樣品后，將樣品和本試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照用常規(guī)試劑盒提取核酸RNA，從上述 試劑盒中取出RT-LAMP反應(yīng)液、酶混合物，引物混合液，DEPC水在室溫下融化后，2000r/min 離心5s;每管測(cè)試反應(yīng)體系加入:RT-LAMP反應(yīng)液，7.5yL;引物混合液，6 yL;酶混合物，2yL; 目視熒光染料，lyL; DEPC水，3.5yL;再分別加入處理后制備的陽(yáng)性對(duì)照和樣品的RNA溶液及 陰性對(duì)照各5yL，蓋緊管蓋，于4000r/min離心5s;將PCR管排好，放入63°C水浴鍋水浴1小時(shí) 或是放入PCR儀運(yùn)行63°C保溫1小時(shí)。
[0011] 反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)，具體包括三種： (一)RT-LAMP反應(yīng)的目視檢測(cè)方法： 陰性對(duì)照呈現(xiàn)淺橘黃色，陽(yáng)性對(duì)照呈熒光綠色，樣品根據(jù)反應(yīng)后管內(nèi)液體的顏色進(jìn)行 判斷陰性陽(yáng)性。
[0012](二)RT-LAMP反應(yīng)的濁度檢測(cè)方法 反應(yīng)結(jié)束后，將所有PCR管進(jìn)行離心lOOOOrpm，lmin，觀察管底，陰性對(duì)照管底無(wú)沉淀， 陽(yáng)性對(duì)照有白色沉淀，樣品根據(jù)有無(wú)白色沉淀進(jìn)行判斷陰陽(yáng)性。
[0013](三)RT-LAMP反應(yīng)的凝膠電泳檢測(cè)方法 用含溴化乙錠（EB)的1.5%瓊脂糖凝膠電泳。在紫外透射儀下觀察核酸帶。陽(yáng)性對(duì)照 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳后，可見(jiàn)從點(diǎn)樣孔的拖尾現(xiàn)象以及很多不同擴(kuò)增長(zhǎng)度的條帶，陰性對(duì)照 無(wú)條帶，樣品根據(jù)電泳后條帶有無(wú)進(jìn)行判斷陰陽(yáng)性。
[00M]有效原則：陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照分別成立。
[0015]本發(fā)明的有益效果為： 1)快速:從樣品處理到出結(jié)果僅需2小時(shí)左右;2)在本發(fā)明中，篩選出最佳引物濃度組 合，克服了兩步法檢測(cè)鴨黃病毒的不足，實(shí)現(xiàn)了一步法RT-LAMP檢測(cè)鴨黃病毒的目的。3)靈 敏:使用該方法比傳統(tǒng)PCR方法靈敏度高10~100倍;4)特異:與常見(jiàn)禽類(lèi)其他病毒不發(fā)生交 叉反應(yīng)，該方法的特異性高于傳統(tǒng)PCR方法，大大杜絕了非特異性擴(kuò)增造成的假陽(yáng)性結(jié)果； 5)本發(fā)明提供了質(zhì)量?jī)?yōu)異的試劑及優(yōu)化的操作程序，因此操作簡(jiǎn)單，具有良好重復(fù)性。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1. RT-LAMP ro染料結(jié)果。1.陰性對(duì)照；2.陽(yáng)性對(duì)照。
[0017]圖2. RT-LAMP瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。1.陽(yáng)性對(duì)照；2.陰性對(duì)照;M. DNA分子標(biāo)準(zhǔn) DL2000〇
[0018] 圖3. RT-LAMP與RT-PCR靈敏度的比較。A. Π )染料結(jié)果;B. RT-LAMP瓊脂糖凝膠電 泳結(jié)果；C. RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果;M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000; 1-9. 10倍梯度 稀釋的病毒RNA(lOllO9) 10.陰性對(duì)照。
[0019] 圖4. RT-LAMP檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果。A.瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果;Β.Π )染料結(jié) 果M.DNA分子標(biāo)準(zhǔn)DL2000 1. 鴨黃病毒;2.禽流感H5N1亞型;3.鴨病毒性腸炎病毒;4、鴨病毒性肝炎病毒。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1.鴨黃病毒RT-LAMP檢測(cè)試劑盒 試劑盒的組成 URT-LAMP反應(yīng)液：內(nèi)含濃度為8mmol/L MgS〇4,5.6mmol/L dNTP Mixture; 2、 引物混合液;檢測(cè)鴨黃病毒的引物組按照F3: B3: FIP: BIP: LF: LB為5nM: 5nM: 40 nM: 40 nM: 20nM: 20nM的比例混合； 其中所涉及的檢測(cè)引物序列為： 上游內(nèi)引物FIP序列： 5'- GCGGCATGTTTCAGCGACTGCATGGTTCCACGGAAGCG -3'， 下游內(nèi)引物BIP序列： 5'-AACGCCCAAAAGTCCCGTCTACGGGGTTCACATTCGAGTGTG -3'. 上游外引物F3序列： 5， -GCAGAAGGAAAACGTCCAGT -3， 下游外引物B3序列： 5 ' -CCCATGTCAACCCCAGATC -3 '， 上游環(huán)引物L(fēng)F序列 5 ' -GGCTGAATAATTGTGGTAGGTGCT -3 '， 下游環(huán)引物L(fēng)B序列 5' -ACCGCTGAGATGGAGGATTATG -3' 1)引物及探針的濃度優(yōu)化:將外引物：內(nèi)引物:環(huán)引物分別按照1:1:1、1:2:1、1:2:2、1: 4:2、1:4:4、1:6:4、1:8:4進(jìn)行組合。其他條件按照表1所列進(jìn)行優(yōu)化 表1 RT-LAMP反應(yīng)體系
采用上述配比對(duì)所提取的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，63°C水浴1小時(shí)，每組均采用復(fù)管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 1 2)優(yōu)化結(jié)果:從多次重復(fù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后外引物：內(nèi)引物:環(huán)引物的最佳比例 為1:8:4，其中外引物濃度為5nM，內(nèi)引物濃度為40nM，環(huán)引物濃度為20nM。
[0022] 3、酶混合物:濃度均為5U/