利用通用報告物的數(shù)字測定的制作方法
【專利說明】利用通用報告物的數(shù)字測定
[0001] 對優(yōu)先權(quán)申請的交叉引用
[0002] 根據(jù)35 U.S.C.§119(e)，本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時專利申請序 列號61/789,703以及2013年8月12日提交的美國臨時專利申請序列號61/864,792的權(quán)益。 這兩個優(yōu)先權(quán)申請的全部內(nèi)容為了所有目的通過引用并入本文。
[0003] 對其他材料的交叉引用
[0004] 本申請為了所有目的通過引用并入下列材料的全部內(nèi)容:2006年5月9日發(fā)布的美 國專利號7,041,481;2010年7月8日公布的美國專利申請公布號2010/0173394 A1;2011年9 月8日公布的美國專利申請公布號2011/0217712 Al;2012年6月21日公布的美國專利申請 公布號2012/0152369 Al;2013年2月14日公布的美國專利申請公布號2013/0040841 A1; 2012年8月23日提交的美國臨時專利申請序列號61/692,635;2013年8月22日提交的美國專 利申請序列號13/973，940; 2013年12月6日提交的美國專利申請序列號14/099,750 ;2014年 2月13日提交的美國專利申請序列號14/171，754; 2014年2月3日提交的美國專利申請序列 號 14/171,761;以及Joseph R.Lakowicz,PRINCIPLES OF FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(第 二版，1999)。
[0005] 盟直
[0006] 測定通常依靠檢測樣品中分析物的單獨(dú)拷貝的存在或活性的能力。在示例性 數(shù)字測定中，樣品被分離為體積基本相等的一組分區(qū)，每個分區(qū)包含平均小于約一個拷貝 的分析物。如果分析物的拷貝隨機(jī)分布在分區(qū)之間，某些分區(qū)將不包含拷貝，其他分區(qū)僅包 含一個拷貝，并且，如果分區(qū)的數(shù)量足夠大，又其他分區(qū)將包含兩個拷貝、三個拷貝和甚至 更多數(shù)量的拷貝。基于分區(qū)中分析物的給定平均濃度在一個分區(qū)中實(shí)際發(fā)現(xiàn)〇個、1個、2個、 3個或更多拷貝的概率，通過泊松分布來描述。相反，分區(qū)中分析物的濃度(并因此樣品中的 濃度)可以從發(fā)現(xiàn)一個分區(qū)中給定數(shù)量的拷貝的概率來估算。
[0007] 沒有發(fā)現(xiàn)拷貝和發(fā)現(xiàn)一個或更多個拷貝的概率的估值可以在數(shù)字測定中測量?？?以檢驗(yàn)每個分區(qū)以確定該分區(qū)是包含分析物的至少一個拷貝的陽性分區(qū)，或是不包含分析 物的拷貝的陰性分區(qū)。分區(qū)中沒有發(fā)現(xiàn)拷貝的概率可以通過為陰性的被檢驗(yàn)分區(qū)的分?jǐn)?shù)來 估計(jì)（"陰性分?jǐn)?shù)"），以及發(fā)現(xiàn)至少一個拷貝的概率通過為陽性的被檢驗(yàn)分區(qū)的分?jǐn)?shù)來估計(jì) ("陽性分?jǐn)?shù)"）。陽性分?jǐn)?shù)或陰性分?jǐn)?shù)隨后可以用于確定分區(qū)中的分析物的濃度，諸如以泊 松統(tǒng)計(jì)。
[0008] 數(shù)字測定往往依賴分區(qū)中核酸靶的擴(kuò)增以使得能夠檢測分析物的單個拷貝。擴(kuò)增 可以經(jīng)由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來進(jìn)行以實(shí)現(xiàn)數(shù)字PCR測定。靶的擴(kuò)增可以從包含在反應(yīng)中 的熒光探針進(jìn)行光學(xué)檢測。具體地，探針可以包括熒光團(tuán)，其提供指示靶是否已被擴(kuò)增的熒 光信號。
[0009] 數(shù)字PCR測定可以被多重化以允許在相同組的分區(qū)中檢測兩個或更多個不同靶的 存在。靶的擴(kuò)增可以通過利用靶特異性的探針來區(qū)分。不過，此類探針可能是昂貴的，并且 可能需要定制合成，這進(jìn)一步增加了成本。
[0010]
[0011] 本公開內(nèi)容提供用于測定一組分區(qū)中的一個或更多個靶的數(shù)字測定系統(tǒng)，包括方 法、設(shè)備和組合物，所述分區(qū)包含靶擴(kuò)增的通用報告物。
[0012] 附圖簡述
[0013] 圖1是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面，執(zhí)行相同組分區(qū)中的至少兩個靶的多重數(shù)字測 定的示例性方法的流程圖，每個分區(qū)包含用于靶的引物和擴(kuò)增的通用報告物。
[0014]圖2是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面，經(jīng)配置以執(zhí)行圖1的方法的選定方面的示例性系 統(tǒng)。
[0015] 圖3是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面，示出經(jīng)執(zhí)行以測定包含通用報告物的分區(qū)中的 一對靶(靶A和B)的圖1方法的選擇的示例性方面的示意圖，用于擴(kuò)增分區(qū)中的靶和用通用 報告物檢測的策略在可從其形成分區(qū)的示例性整體相(bulk phase)中展示(擴(kuò)增箭頭和擴(kuò) 增子以虛線示出）。
[0016] 圖4是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面的示例性數(shù)據(jù)的圖，該數(shù)據(jù)包括可以從對如圖3中 的靶A和B的測定的不同組的分區(qū)（通道1-5)中收集的熒光幅值(例如，熒光強(qiáng)度（int..))， 每個組中存在靶B引物(Fb和Rb)的不同濃度，并且在該圖中標(biāo)識了每個條帶的分區(qū)。
[0017]圖5是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面的分區(qū)中的擴(kuò)增子大小與從該分區(qū)測量的熒光強(qiáng) 度（int.)之間的示例性關(guān)系的圖。
[0018] 圖6是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面的示例性數(shù)據(jù)的圖，該數(shù)據(jù)包括可以從如對圖3中 的靶A和B的測定的不同組的分區(qū)(通道1-5)中收集的熒光幅值(例如，熒光強(qiáng)度），生成對每 個組中的靶B的不同擴(kuò)增子大小，并且在該圖中標(biāo)識了每個條帶的分區(qū)。
[0019] 圖7是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面的對如在圖4中收集和呈現(xiàn)的示例性數(shù)據(jù)的圖，但 是極大數(shù)量的分區(qū)對兩個靶是陽性的。
[0020] 圖8是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面，示出經(jīng)執(zhí)行以測定具有相同通用報告物的分區(qū) 中的一對靶(祀A和B)的圖1的方法的選擇的示例性方面的另一示意圖，該圖基本如圖3所示 構(gòu)建，并且示出了使用具有不同解鏈溫度的引物以生成該靶對的相同長度的擴(kuò)增子，但是 以不同的效率產(chǎn)生不同的擴(kuò)增子產(chǎn)量。
[0021] 圖9是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面示例性數(shù)據(jù)的圖，該數(shù)據(jù)包括可以從根據(jù)圖8的相 同反應(yīng)混合物形成的不同組的分區(qū)（通道1-5)中收集的熒光幅值，靶的擴(kuò)增單一退火溫度 下在孔中執(zhí)行，該孔包含優(yōu)化到這一退火溫度的引物組以及未優(yōu)化到這一退火溫度但是仍 然能夠以較低的效率擴(kuò)增的一個引物組，且圖中的每個條帶的分區(qū)根據(jù)靶含量標(biāo)識。
[0022]圖10是大體根據(jù)在圖4和7中描述的策略，從液滴收集的熒光幅值數(shù)據(jù)的曲線圖。 [0023]圖11是大體根據(jù)在圖5和6中描述的策略，從液滴收集的熒光幅值數(shù)據(jù)的曲線圖。 [0024]圖12是大體根據(jù)在圖8和9中描述的策略，從液滴收集的熒光幅值數(shù)據(jù)的曲線圖。
[0025] 圖13A到13D是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面，在擴(kuò)增液滴的β-葡糖醛酸酶(GUSB)靶的 剪接形式和未剪接形式后，在來自包含樣品(分別是Α到D)的不同稀釋度的液滴的一對波長 方案（通道1和通道2)中收集的擴(kuò)增數(shù)據(jù)的散點(diǎn)圖，每個液滴包含相同的通用報告物（ EvaGreen?染料），并且液滴的每個簇根據(jù)靶含量來標(biāo)識(分別是剪接/未剪接）。
[0026] 圖14是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面，從圖13A到13D(樣品A到D)的數(shù)據(jù)計(jì)算的GUSB靶 的剪接形式和未剪接形式的濃度以及每個樣品的計(jì)算的靶濃度的比率(剪接:未剪接）的 圖。
[0027] 圖15是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面，從在具有通用報告物的液滴中執(zhí)行的三個不同 的靶基因（cDNA)測定收集的擴(kuò)增數(shù)據(jù)的圖，每個靶基因（cDNA)測定檢測來自靶基因的不同 剪接形式的 cDNA(CAMTAl、TPM3或ABUM1)。
[0028] 圖16是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面，通過在來自圖15的靶基因測定的液滴中生成的 擴(kuò)增子的毛細(xì)管電泳獲得的擴(kuò)增數(shù)據(jù)的曲線圖。
[0029]圖17是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面，使用來自如在圖15中執(zhí)行的ABLIM1測定的擴(kuò)增 數(shù)據(jù)，在包含通用報告物和測定的腦RNA樣品的不同的濃度的液滴中對長的選擇性剪接形 式的和短的選擇性剪接形式的ABUM1 cDNA計(jì)算的濃度的圖解。
[0030] 圖18是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面，從在具有通用報告物的液滴中執(zhí)行的三種不同 的選擇性剪接測定(ABLIM1、TPM3和CAMTA1)收集的擴(kuò)增數(shù)據(jù)的一系列散點(diǎn)圖，每種不同的 剪接測定使用從三種不同組織源(腦、心臟和骨骼肌)獲得的RNA/cDNA，并且每個曲線中的 液滴的每個簇根據(jù)選擇性剪接的靶的靶含量(短形式(S)/長形式(L))來標(biāo)識。
[0031] 圖19是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面，從在具有通用報告物和從多種指示的組織源之 一獲得的RNA/cDNA的液滴中進(jìn)行的三種不同選擇性剪接測定(ABUM1、CAMTA1和TPM3)計(jì)算 的濃度數(shù)據(jù)(長形式(L)百分比）的圖解。
[0032] 圖20是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面，示出可以從包含通用報告物的分區(qū)獲得的擴(kuò)增 數(shù)據(jù)的示意圖，隨著時間推移出現(xiàn)陽性分區(qū)的檢測的信號幅值的衰減（左側(cè)），或通過熱調(diào) 節(jié)穩(wěn)定的信號幅值(右側(cè)）。
[0033] 圖21是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面，示出可以從通過通用報告物進(jìn)行的三種不同的 靶(A、B和C)的單重測定和多重測定獲得的擴(kuò)增數(shù)據(jù)的示意圖，對于每個靶的擴(kuò)增策略在對 應(yīng)的數(shù)據(jù)部分的上方示意性地示出。
[0034] 圖22是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面，對從模板和各種引物二聚體擴(kuò)增的靶的示意性 比較，該引物二聚體可以與僅通過一個靶和通用報告物執(zhí)行的圖1的數(shù)字測定中的靶區(qū)分 開。
[0035]圖23是根據(jù)本公開內(nèi)容的各方面，可以在具有圖22中的引物和模板的數(shù)字測定中 收集的示例性發(fā)光數(shù)據(jù)的曲線圖，至少一個副產(chǎn)物（引物二聚體）只在液滴的子集（陰性靶 液滴)中被擴(kuò)增。
[0036] 登述
[0037] 本公開內(nèi)容提供用于測定一組分區(qū)中的一個或更多個靶的數(shù)字測定系統(tǒng)，包括方 法、設(shè)備和組合物，所述分區(qū)包括靶擴(kuò)增的通用報告物。
[0038] 提供一種執(zhí)行數(shù)字測定的示例性方法。在該方法中，可以形成分區(qū)，每個分區(qū)包括 相同混合物的一部分?；旌衔锟梢园谝话泻偷诙?，并且還可以包含對任一靶的擴(kuò)增 靈敏的通用報告物。只有一個子集的分區(qū)各自可以包含第一靶的至少一個拷貝，以及只有 一個不同子集的分區(qū)各自可以包含第二靶的至少一個拷貝。第一靶和第二靶可以在分區(qū)中 擴(kuò)增。擴(kuò)增數(shù)據(jù)可以從用于多個分區(qū)的通用報告物收集。分區(qū)中第一靶的擴(kuò)增可以與第二 靶的擴(kuò)增區(qū)分開?？梢源_定每個靶的水平。
[0039] 提供執(zhí)行數(shù)字測定的另一種示例性方法。在該方法中，可以形成分區(qū)，每個分區(qū)包 括相同混合物的一部分。混合物可以包含靶并且還可以包含對靶的擴(kuò)增靈敏的通用報告 物。只有一個子集的分區(qū)各自可以包含靶的至少一個拷貝。靶和至少一種副產(chǎn)物可以在分 區(qū)中擴(kuò)增。擴(kuò)增數(shù)據(jù)可以從用于多個分區(qū)的通用報告物收集。靶和副產(chǎn)物在分區(qū)中的擴(kuò)增 可以在數(shù)據(jù)中彼此區(qū)分開，或靶和副產(chǎn)物在分區(qū)中的擴(kuò)增都不可以在數(shù)據(jù)中彼此區(qū)分開。 可以確定靶的水平。
[0040] 提供執(zhí)行數(shù)字測定的又一種示例性方法。在該方法中，可以形成分區(qū)，每個分區(qū)包 括相同混合物的一部分?；旌衔锟梢园幸约皩Π械臄U(kuò)增靈敏的通用報告物。只有一個 子集的分區(qū)各自可以包含靶的至少一個拷貝。分區(qū)可以經(jīng)熱循環(huán)以擴(kuò)增靶。來自熱循環(huán)的 分區(qū)的待檢測的信號可以通過將分區(qū)冷卻到室溫以下、將分區(qū)加熱到80攝氏度以上并將分 區(qū)再次冷卻到室溫以下來穩(wěn)定?？梢詮挠糜诙鄠€分區(qū)的通用報告物收集擴(kuò)增數(shù)據(jù)。可以確 定革G的水平。
[0041] 提供執(zhí)行多重數(shù)字測定的又另一種方法。在該方法中，可以選擇引物及其濃度用 于第一和第二靶的擴(kuò)增，以生成可用通用報告物區(qū)分開的對應(yīng)的第一和第二擴(kuò)增子。可以 形成分區(qū)，每個分區(qū)包含通用報告物和在選擇的濃度的引物。用于每個靶的模板可以局部 占有存在于分區(qū)中。第一靶和第二靶可以在分區(qū)中擴(kuò)增。由通用報告物發(fā)射的光可以從單 個分區(qū)檢測。每個靶的水平可以基于檢測的光來確定。
[0042] 提供用于執(zhí)行多重測定的組合物。組合物可以包含多個液滴，每個液滴包含足以 擴(kuò)增第一靶和第二靶的擴(kuò)增試劑，并且還包含對任一靶的擴(kuò)增靈敏的通用報告物。只有液 滴的子集各自可以包含第一靶的至少一個拷貝，以及只有液滴的不同子集各自可以包含第 二靶的至少一個拷貝。連續(xù)相可以圍繞每個液滴。
[0043] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是在生物醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷和法醫(yī)學(xué)等等中普遍存在的 技術(shù)。受過技術(shù)訓(xùn)練的人員熟悉各種形式的多重PCR，包括端點(diǎn)多重PCR、多重基于探針的定 量PCR和基于SYBR?染料的多重化。這些方法中的每種方法有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。端點(diǎn)PCR可以 支持高水平的多重化，但是通常需要消耗時間的凝膠電泳以檢測擴(kuò)增的產(chǎn)物。多重基于探 針的定量PCR是動力學(xué)（"實(shí)時"）測定，該測定不像端點(diǎn)PCR，不需要PCR后的處理用于檢測， 但是擴(kuò)增子檢測受儀器性能限制?？缮藤彽膶?shí)時PCR儀器可以支持使用多達(dá)四個熒光團(tuán)并 因此支持使用四個探針，多重化受四個擴(kuò)增子限制（每個探針一個擴(kuò)增子）。最后，基于 SYBR?染料的多重化是便宜的，因?yàn)樗恍枰獦?biāo)記的探針并且較不耗時。不過，該方法依 賴熔融曲線分析來檢測各種PCR產(chǎn)物，并且不允許產(chǎn)物的直接定量。而且，熔融曲線分析可 能不具有區(qū)分具有類似解鏈溫度的擴(kuò)增子的分辨率。目前沒有方法可用于僅使用DNA嵌入 染料作為擴(kuò)增報告物直接檢測和定量在單管中擴(kuò)增的多個DNA靶。
[0044] 本公開內(nèi)容提供用于分區(qū)諸如乳滴中的多重PCR以及用DNA嵌入染料對其檢測的 新穎方法。該方法包括多個DNA靶的擴(kuò)增、檢測和定量。靶擴(kuò)增可以在具有DNA嵌入染料例如 EvaGreen?染料以及若干引物對諸如用于每個靶的一引物對的標(biāo)準(zhǔn)PCR混合物中完成?？?以以操縱每個靶的擴(kuò)增子產(chǎn)率的方式將不同濃度的引物對組合在各種混合物中?；诋a(chǎn) 率，擴(kuò)增的產(chǎn)物可以根據(jù)從嵌入染料檢測到的信號幅值被區(qū)分開。
[0045] 該策略的要素可以是通過改變引物濃度操縱熒光輸出的能力。引物濃度直接影響 產(chǎn)率并且間接影響擴(kuò)增子結(jié)合的染料的熒光。用于多重反應(yīng)中每個靶的引物濃度可以進(jìn)行 調(diào)節(jié)以對多個擴(kuò)增的靶中的每個產(chǎn)生不同信號幅值。擴(kuò)增的靶可以通過數(shù)據(jù)中的相應(yīng)的擴(kuò) 增簇的位置來標(biāo)識和通過在每個簇中存在的分區(qū)的數(shù)量來定量。
[0046] 本文公開的方法可以允許只使用DNA結(jié)合染料作為報告物檢測和定量在單孔中擴(kuò) 增的相同或不同大小的多個擴(kuò)增子。這種方法比常規(guī)的端點(diǎn)PCR多重化具有優(yōu)點(diǎn)。例如，該 方法節(jié)約時間：不需要PCR產(chǎn)物的進(jìn)一步處理，例如凝膠電泳和成像以檢測擴(kuò)增子?？蛇x地 或另外地，該方法可以提供擴(kuò)增子大小的獨(dú)立性:類似(例如，相等)或不同長度的擴(kuò)增子可 以從相同的多重反應(yīng)檢測到。與之相比，類似長度的擴(kuò)增子通常不能被凝膠電泳分辨，限制 了在常規(guī)端點(diǎn)PCR中多重化類似大小擴(kuò)增子的能力。本文公開的方法不同于多重基于探針 的定量PCR，因?yàn)樵摲椒梢圆皇褂眯蛄刑禺愋蕴结榿韴?zhí)行，序列特異性探針比嵌入染料明 顯更貴。本文公開的方法不同于使用實(shí)時儀器的基于SYBR?染料的多重話。例如，擴(kuò)增子 可以在沒有熔融曲線分析的情況下區(qū)分開。
[0047]本公開內(nèi)容的進(jìn)一步方面在下列章節(jié)中展示：（1)以通用報告物的多重數(shù)字測定 的綜述以及(II)實(shí)施例。
[0048] I.以通用報告物的多重數(shù)字測定的綜述
[0049] 本節(jié)提供用通用報告物執(zhí)行的多重數(shù)字測定的綜述;參見圖1-9。
[0050] 圖1是用通用報告物執(zhí)行多重數(shù)字測定的示例性方法50的流程圖。對方法50呈現(xiàn) 的步驟可以以任何合適的順序和以任何合適的組合來執(zhí)行。此外，所述步驟可以與本公開 內(nèi)容的任何其他合適步驟、方面和/或特征組合和/或被任何其他合適步驟、方面和/或特征 更改，所述其他合適步驟、方面和/或特征包括在上面交叉引用中列出的通過引用并入本文 的專利文獻(xiàn)中描述的那些。
[0051] 在52指示，可以選擇引物及其濃度以生成用在分區(qū)中的通用報告物可區(qū)分開的至 少一對擴(kuò)增子。當(dāng)通用報告物結(jié)合到擴(kuò)增子時，相對于未結(jié)合或結(jié)合到單鏈核酸，通用報告 物可以更明亮地發(fā)熒光。每個擴(kuò)增子(可互換地稱為擴(kuò)增靶)可以是雙鏈的并且可以對應(yīng)于 被擴(kuò)增的不同靶。擴(kuò)增子可以在分區(qū)中彼此區(qū)分開，因?yàn)槊總€擴(kuò)增子用不同的特征產(chǎn)率生 成(所述特征產(chǎn)率可以使用任何合適的量度，例如擴(kuò)增子的質(zhì)量、總組合長度等來描述）。結(jié) 果是結(jié)合到分區(qū)中的每個擴(kuò)增子的通用報告物的特征、不同量以及從結(jié)合的報告物檢測到 的熒光的可區(qū)分幅值。可以生成擴(kuò)增子對的質(zhì)量的不同產(chǎn)率，因?yàn)閿U(kuò)增子對為不同長度和/ 或被復(fù)制至不同的最終拷貝數(shù)和/或質(zhì)量。
[0052] 擴(kuò)增子對可以是被擴(kuò)增到單個分區(qū)中的相同拷貝數(shù)的更長擴(kuò)增子和更短擴(kuò)增子。 在這種情況下，更長擴(kuò)增子通常比更短擴(kuò)增子結(jié)合更多的報告物拷貝并且給出更強(qiáng)的熒光 信號。在其他情況下，在其他事物相等的情況下，更長擴(kuò)增子可以被擴(kuò)增到比更短擴(kuò)增子更 少的拷貝數(shù)。
[0053]擴(kuò)增子對可以在長度方面類似或等同并