用于治療糖尿病的修飾的ingap肽的制作方法
【專利說明】
[0001 ] 優(yōu)先權(quán)要求
[0002] 本申請要求2013年2月15日提交的美國臨時(shí)專利申請第61/765,203號(hào)的優(yōu)先權(quán)， 其內(nèi)容被明確地引作參考。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防糖尿病的具有胰島辟田胞新生或再生活性的INGAP肽 及其組合物和方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 糖尿病影響了全世界超過1億的個(gè)體。在美國，那些被糖尿病影響的患者的估計(jì)的 醫(yī)療費(fèi)用為大約每年1360億美元。糖尿病為新陳代謝紊亂，其具有胰腺不能分泌足夠量的 胰島素的特點(diǎn)，其引起血糖水平的大波動(dòng)并且既具有短期又具有長期的生理后果。在患有1 型糖尿病(胰島素依賴型糖尿病或IDDM)的患者中起因于升高的血糖水平(高血糖癥）的長 期并發(fā)癥包括視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病、腎病和其他血管并發(fā)癥。低的血糖水平(低血糖癥)會(huì)導(dǎo)致 糖尿病昏迷、癲癇發(fā)作、意外事件(accidents)、缺氧、腦損害、認(rèn)知功能下降和死亡。
[0005] 2型糖尿病，也已知為非胰島素依賴型糖尿病或NIDDM，是一種進(jìn)行性疾病，其具有 受損的葡萄糖代謝的特點(diǎn)，該受損的葡萄糖代謝引起升高的血糖水平。患有2型糖尿病的患 者呈現(xiàn)出受損的胰腺β細(xì)胞功能，該受損的胰腺β細(xì)胞功能引起在對高血糖信號(hào)做出響應(yīng) 時(shí)，胰腺辟田胞不能分泌合適量的胰島素；以及在它的靶組織中對胰島素作用的抵抗(胰島 素抵抗）。
[0006] 現(xiàn)在2型糖尿病的治療目的在于逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗，控制腸葡萄糖的吸收，正?；?臟葡萄糖的生產(chǎn)和提高辟田胞葡萄糖感知以及胰島素分泌。因?yàn)楝F(xiàn)在糖尿病治療的缺點(diǎn)，1 型和2型糖尿病的新療法以及新的診斷和預(yù)后方法是亟需的。
[0007] 越來越多的證據(jù)表明不足的辟田胞團(tuán)構(gòu)成1型和2型糖尿病的起因。因此，在糖尿病 患者中細(xì)胞的再生是糖尿病研究的重要目標(biāo)。近些年，有越來越多的興趣在開發(fā)誘導(dǎo)辟田 胞再生和新的胰島原位形成的新策略上（Baggio，L. L.和Drucker，D. J .，2006，Annu Rev Med ,57:265-281 )。因此，具有刺激剩余的β細(xì)胞團(tuán)擴(kuò)大的能力或具有胰島新生活性的生物 活性分子的鑒定對于控制原生胰腺(native pancreas)的再生潛能是關(guān)鍵性的。
[0008] 胰島新生相關(guān)蛋白（INGAP)是最初在部分阻塞的倉鼠胰腺的粗提物中發(fā)現(xiàn)的一種 16.8kDa蛋白（Rosenberg，L.等人，1988，Diabetes,37:334-341;美國專利第5,834,590號(hào)）。 INGAP在胰腺和十二指腸中表達(dá)，并且在幾個(gè)物種中已經(jīng)表現(xiàn)出誘導(dǎo)胰島新生(Rosenberg, L.等人，1996 ,Diabetologia,39: 256-262 ;Rosenberg,L.等人，2004,Ann Surg 240 :875-884)。在結(jié)構(gòu)上，INGAP是分泌的C型外源凝集素 Reg家族的一員，該家族含有多于25個(gè)成員， 基于一級序列被分為4個(gè)亞家族（21^1^，￥.￥.等人，2003，￥〇1'1(116381：1'〇611丨61'〇1，9:2635-2641;0kamoto，H.，1999，J Hepatobiliary Pancreat Surg 6:254-262)。
[0009] INGAP屬于大的Reg 3亞家族，其已經(jīng)在大鼠、小鼠、倉鼠和人的主要胃腸組織(胰 腺、胃、肝臟）中被識(shí)別（Rafaeloff，R.等人，1997，J Clin Invest 99:2100-2109)。盡管Reg 蛋白普遍存在，但是關(guān)于它們的功能或作用機(jī)制知道的不太多。雖然Reg 1被認(rèn)為是辟田胞 促分裂原，但是關(guān)于Reg 3家族的功能知之甚少。
[0010]大量研究提示Regs可以結(jié)合特異性細(xì)胞表面受體并激活多個(gè)信號(hào)通路。支持這個(gè) 受體假說的一個(gè)論點(diǎn)是INGAP的生物活性看起來是由該蛋白的一個(gè)15個(gè)氨基酸片段(氨基 酸104-118)介導(dǎo)的，即INGAP肽（INGAP-P)，其由高度保守的IGLHDP基序和在Reg家族的其它 成員中沒有被發(fā)現(xiàn)的單一序列SHGTLPNGS組成(Rafaeloff，R.等人，1997, J Clin Invest 99:2100-2109)。合成的INGAP肽已經(jīng)被證明在倉鼠和小鼠中誘導(dǎo)新的胰島形成和逆轉(zhuǎn)鏈脲 霉素誘導(dǎo)的糖尿病上如所述蛋白質(zhì)一樣有效(Rosenberg，L.等人，1996, Diabetologia, 39: 256-262;Rosenberg，L·等人，2004，Ann Surg 240:875-884)，并且因此是所述受體的可能 配體。合成的INGAP-P的生物效應(yīng)在體外和體內(nèi)均被廣泛研究。至今，已經(jīng)顯示INGAP-P: 1) 在從去分化的、胰島來源的導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)功能性的人胰島的體外再生(Jamal，A.M.等人， 2005，Cell Death Differ ,12:702-712); 2)劑量依賴地刺激嚙齒目動(dòng)物、狗和食蟹猴中β細(xì) 胞團(tuán)的擴(kuò)大（Lipsett，M.等人，2007，Cell Biochem Biophys，48:127-137;Pittenger，G.L. 等人，2007，Pancreas，34:103-111)和3)增加胰島素的分泌和β細(xì)胞尺寸以及在體外上調(diào)大 鼠新生胰島中與β細(xì)胞功能相關(guān)的幾種基因的表達(dá)(Barbosa，Η.等人，2006，Regul Pept， 136:78-84 ;Borelli，M. I ·等人，2005，Regul Pept, 13 1:97-102)。這些重要的結(jié)果跟隨有 臨床試驗(yàn)以研究它在人中的功效和安全性，其中INGAP-P被發(fā)現(xiàn)有改善葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡的 信號(hào)效果，其被在患有2型糖尿病的患者中在90天中糖基化血紅蛋白（HbAlC或A1C)減少和 在患有1型糖尿病的患者中C-肽分泌的顯著增加所證實(shí)(Dungan，K.M.等人，2009，Diabete S Metab Res Rev,25:558-565)〇
[0011]盡管這些數(shù)據(jù)提示INGAP-P既具有胰島新生活性又具有促胰島素活性，從動(dòng)物研 究和人類實(shí)驗(yàn)顯而易見INGAP(INGAP-P)的15-mer缺乏穩(wěn)定性。相應(yīng)地，為了達(dá)到所要求的 血清和組織閾值水平，必須以非常大的劑量給藥。不良的穩(wěn)定性也導(dǎo)致(比如)藥物制劑、局 部注射部位反應(yīng)的患者接受和高費(fèi)用的問題。因此，存在與INGAP-P相比具有可比的或更大 的體內(nèi)生物活性和/或更大的穩(wěn)定性或更長的半衰期的INGAP類似物的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]以前我們識(shí)別了一種叫做胰島新生相關(guān)蛋白（INGAP)的胰腺蛋白，該蛋白是REG3 蛋白的跨種哺乳動(dòng)物家族的一員（參見圖19)，并且可以誘導(dǎo)胰島再生倉鼠模型中的導(dǎo)管細(xì) 胞分化為β胰島細(xì)胞(Rosenberg，L·等人，J Surg Res，1983，35:63-72;Rosenberg，L·等人， Diabetes，1988，37: 334-341 ;Rosenberg，L.等人，Diabetologia, 1996，39: 256-262)。一種 含有氨基酸104-118的INGAP蛋白的15-mer肽片段(INGAP-P)被確定為INGAP的生物活性中 心。
[0013] INGAP和INGAP-P均被證明能誘導(dǎo)導(dǎo)管細(xì)胞分化為胰島。在人的胰島再生體外模型 中，INGAP-P誘導(dǎo)胰腺發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子PDX-1的增強(qiáng)表達(dá)和新的胰島的同時(shí)形成(Jamal，A.M. 等人，Cell Death Differ.，2003，10:987-996;Jamal, Α·Μ·等人，Cell Death Differ·, 2005，12:702-712)。在動(dòng)物模型中，INGAP-P誘導(dǎo)導(dǎo)管細(xì)胞體外增殖和胰島細(xì)胞從與導(dǎo)管上 皮相關(guān)的細(xì)胞的再生，導(dǎo)致在正常成年小鼠、倉鼠和狗的胰腺中新的胰島形成。在STZ(鏈脲 佐菌素)處理的糖尿病C57BL/6J小鼠模型中，INGAP-P逆轉(zhuǎn)了糖尿病癥狀(Pittenger，G.L. 等人，Pancreas ,2007,34:103-111; Rosenberg，L ·等人，Ann · Surg ·，2004，240 :875-884 (2004) ;Kapur，R.等人，INGAP Induces Duct Cell Proliferation In Vitro and beta Cell Formation in Normal Non Diabetic Mice,71st ADA Meeting,圣地亞哥，2011)。在 已建立的（不是新開始的）自身免疫的1型糖尿病(T1DM)的NOD小鼠模型中，與免疫調(diào)節(jié)劑 IL-12抑制劑利索茶堿結(jié)合的INGAP-P誘導(dǎo)高血糖癥的減輕并根除了對胰島素顆粒的需要 (Tersey，S.A.等人，Unique Drug Combination for Reversal of Type IDiabetes,68th Scientific Sessions American Diabetes Association(ed.ADA)，舊金山，加利福尼亞， 2008;Tersey，S.A.等人，Journal of Diabetes Mellitus,2012,已付印）。組織學(xué)檢查證實(shí) 了新的胰島的證據(jù)。
[0014] 在人類實(shí)驗(yàn)中，INGAP-P已經(jīng)在1型糖尿病(T1DM)患者和2型糖尿病(T2DM)患者的1 期和2期研究中被評價(jià)(Dungan，K.M.等人，Diabetes Metab Res Rev,2009,25:558-565)。 每日一次INGAP-P注射3個(gè)月引起在T1DM患者中所刺激的C-肽分泌在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著增加 以及在T2DM患者中增加的C-肽水平的趨勢。糖基化血紅蛋白（HbA lc)在T2DM患者中-0.6 % (p 〈0.0125)的減少并在T1DM患者中-0.4% (p〈0.06)的減少。
[0015]盡管這些高度有希望的結(jié)果，INGAP-P的相對短的血漿半衰期繼續(xù)表現(xiàn)出對于 INGAP-P作為治療藥的用途的挑戰(zhàn)。
[0016] 相應(yīng)地，本文提供保留INGAP-P的一種或多種生物活性并且適于作為治療藥開發(fā) 的INGAP肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽具有與INGAP-P相比可比的或更大的體內(nèi)生物 活性和/或更大的穩(wěn)定性或更長的半衰期。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本文提供包含SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6所示的序列的肽。 [0018]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本文提供由SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6所示的序列組成的 肽。
[0019] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽誘導(dǎo)胰腺辟田胞新生，誘導(dǎo)胰腺辟田胞再生，提高葡 萄糖動(dòng)態(tài)平衡和/或逆轉(zhuǎn)個(gè)體中的高血糖癥。
[0020] 本文還提供本發(fā)明的肽的類似物、同系物、片段或變體，其中所述類似物、同系物、 片段或變體具有所述肽的生物活性。類似物、同系物、片段或變體可以具有與本發(fā)明所述肽 的至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。所述生物 活性可以是(比如)所述肽的細(xì)胞或受體結(jié)合特異性、誘導(dǎo)胰腺β細(xì)胞新生的能力、誘導(dǎo)胰島 細(xì)胞再生的能力、改善葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡的能力和/或逆轉(zhuǎn)個(gè)體中高血糖癥的能力。
[0021] 也提供含有編碼本發(fā)明的肽或其類似物、同系物、片段或變體的核酸序列的核酸 分子。核酸分子可以可操作地連接到一個(gè)表達(dá)控制序列以形成一個(gè)表達(dá)載體，其中所述表 達(dá)載體在合適的細(xì)胞中增殖。
[0022] 也提供包含本發(fā)明的肽或其類似物、同系物、片段或變體以及藥學(xué)上可接受的載 體或賦形劑的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物被改為適于口服。在另一個(gè)實(shí)施方式 中，組合物被改為適于通過注射給藥。
[0023] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供包括對需要其的個(gè)體給藥本發(fā)明的肽或其類似物、同 系物、片段或變體或組合物的預(yù)防或治療胰腺癥狀或疾病的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述 癥狀或疾病為新陳代謝紊亂。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述癥狀或疾病為細(xì)胞相關(guān)的紊亂。 在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述癥狀或疾病為1型糖尿病、2型糖尿病或糖尿病的并發(fā)癥。
[0024] 在一些實(shí)施方式中，由凋亡或壞死引起的辟田胞死亡在個(gè)體中通過給藥本發(fā)明的 肽或其類似物、同系物、片段或變體或組合物被阻止或抑制。在其他實(shí)施方式中，個(gè)體中的 胰腺細(xì)胞的功能被改善或恢復(fù)，個(gè)體中的血漿胰島素水平是增加的，個(gè)體中的胰腺β細(xì)胞的 量或尺寸是增加的，個(gè)體中胰腺導(dǎo)管細(xì)胞來源的β細(xì)胞再生是被刺激的，個(gè)體中的葡萄糖動(dòng) 態(tài)平衡被恢復(fù)或改善和/或個(gè)體中的高血糖被逆轉(zhuǎn)。
[0025] 本發(fā)明的肽和組合物可以通過注射、口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下給藥。在 一個(gè)實(shí)施方式中，肽和組合物是口服給藥的，每天一次。
[0026] 在一個(gè)特別的實(shí)施方式中，個(gè)體為人。
[0027] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽是與第二治療劑給藥的。第二治療劑可以與本發(fā) 明的肽伴隨給藥，或第二治療劑和肽可被順序給藥。在一個(gè)實(shí)施方式中，第二治療劑對于1 型或2型糖尿病是治療性的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二治療劑為阿那白滯素。
[0028] 還提供了用于治療胰功能不全的藥物組合物，該組合物含有本發(fā)明的肽和藥學(xué)上 可接受的載體或賦形劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，肽或組合物能刺激胰腺導(dǎo)管細(xì)胞來源的β細(xì)胞 再生。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肽或組合物具有哺乳動(dòng)物INGAP蛋白的生物活性。在一個(gè)實(shí)施 方式中，生物活性是刺激胰腺導(dǎo)管樣細(xì)胞或?qū)Ч芟嚓P(guān)的細(xì)胞生長和增殖的能力。
[0029] 還提供了編碼本文描述的本發(fā)明的肽或其類似物、同系物、片段或變體的核酸分 子。核酸分子可以（比如)被連接到一個(gè)表達(dá)控制序列以形成一個(gè)表達(dá)載體，其中所述表達(dá) 載體在合適的細(xì)胞中增殖。
[0030] 在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供含有本文描述的肽或其類似物、同系物、片段或 變體以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。
[0031] 本文還提供用于預(yù)防或治療胰腺癥狀或疾病的方法，該方法包括對需要其的個(gè)體 給藥本發(fā)明的肽或其類似物、同系物、片段或變體。在本文提供的方法中，個(gè)體可以是（比 如)嚙齒目動(dòng)物、犬科動(dòng)物、豬、靈長目動(dòng)物或人。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施方式中，癥狀或疾病為新陳代謝紊亂，比如細(xì)胞相關(guān)的紊亂。癥狀或 疾病可以是1型糖尿病、2型糖尿病或糖尿病的并發(fā)癥。
[0033] 在另外的實(shí)施方式中，個(gè)體中的β細(xì)胞凋亡被阻止或抑制;個(gè)體中的胰腺細(xì)胞的功 能被改善或恢復(fù);個(gè)體中的血漿胰島素水平增加;和/或個(gè)體中的胰腺細(xì)胞的數(shù)量或尺寸增 加。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述胰腺細(xì)胞為β細(xì)胞。
[0034] 在又一個(gè)實(shí)施方式中，辟田胞新生被刺激和/或個(gè)體中的葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡改善和/ 或個(gè)體中的胰島素是增效的。
[0035] 附圖簡述
[0036] 本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】現(xiàn)在會(huì)通過實(shí)施例和參考隨附的附圖的方式被解釋。
[0037]圖1顯示了RIN-m5F細(xì)胞中INGAP在增殖上的效果。（A):INGAP增加了溴脫氧核苷尿 嘧啶(BrdU)摻入。在小室載玻片上用指示量的INGAP-P或r-INGAP處理RIN-m5F細(xì)胞24小時(shí)。 Exendin 4(Ex4)和表皮生長因子(EGF)用作對照。在處理的最后三小時(shí)加入50μΜ BrdU，接 著在甲醇中固定和進(jìn)行BrdU免疫染色。數(shù)據(jù)以INGAP處理的比未處理的對照中BrdU( + )細(xì)胞 的比例（％)進(jìn)行表示。結(jié)果是3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差（S.E.)(*:p〈0.05，§:p〈 0.001，與未處理的對照相比）。（B): INGAP誘導(dǎo)RIN-m5F中Erk 1 /2的磷酸化。用INGAP處理接 種在60mm組織培養(yǎng)板上的RIN-m5F細(xì)胞（1 X 106)，持續(xù)指示的時(shí)間。用抗Erkl/2磷酸 (Thr202/Tyr204)抗體探測印跡（30yg蛋白質(zhì)），接著清除/用抗總Erkl/2抗體（Cell Signaling)再探測，并使用ImageJ軟件通過密度計(jì)量學(xué)定量。（C):量化相對的Erkl/2磷酸 化，該相對的Erkl/2磷酸化作為磷酸Erkl/2對總Erkl/2的比例被測定，并表示為相對于 Omin時(shí)間點(diǎn)的倍數(shù)變化。結(jié)果是3至8個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差: p〈0.05，§ : p〈 0.01，1: P〈〇. 〇〇 1; t:僅針對所示的時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行兩個(gè)實(shí)驗(yàn)）。
[0038]圖2顯示了熒光標(biāo)記的rINGAP在細(xì)胞表面形成帽（cap)。接種在小室載玻片上的 RIN-m5F細(xì)胞在37°C或在冰上用50nM經(jīng)DyLight 488活性染料標(biāo)記的rINGAP孵育所示的時(shí) 間，并于冰上在4%多聚甲醛中固定。（A):在冰上預(yù)冷細(xì)胞15min，并與rINGAP和CTB (AlexaFluor-594，5μg/ml，Invitrogen)孵育30min。（B):同樣地用轉(zhuǎn)鐵球蛋白（25μg/ml， Texas Red, Invitrogen)。（C)、（D) :37°C下分別用CTB和轉(zhuǎn)鐵球蛋白孵育lh。（E)、（F):用標(biāo) 記的rINGAP將細(xì)胞孵育5h或24h，并在最后一小時(shí)用50nM LysoTracker Red DND99(LT, Invitrogen)共染色。細(xì)胞核用包含在封固劑(Prolong Gold, Invitrogen)中的DAPI復(fù)染。 用奧林巴斯FVlOi共聚焦顯微鏡獲取圖像。標(biāo)尺為20μπι。
[0039] 圖3顯示了熒光標(biāo)記的rINGAP的結(jié)合和內(nèi)化被100ηΜ的渥曼青霉素和細(xì)胞松弛素 D 部分抑制，提示巨胞飲(macropinocytosis)。在渥曼青霉素（100nM)或細(xì)胞松弛素 D(25yg/ ml)存在下，接種在小室載玻片上的RIN-m5F細(xì)胞用50nM經(jīng)DyLight 488活性染料標(biāo)記的r-INGAP孵育5h，并在4%多聚甲醛中固定。(A) :rINGAP，沒有抑制；（B):陰性對照；（C):渥曼青 霉素；（D):細(xì)胞松弛素 D。細(xì)胞核用包含在封固劑(Prolong Gold, Invitrogen)中的DAPI復(fù) 染。用奧林巴斯FVlOi共聚焦顯微鏡獲取圖像。
[0040] 圖4顯示了 FAM標(biāo)記的INGAP-P被快速地內(nèi)化到RIN-H15F細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。用FAM標(biāo)記 的INGAP-P將生長在小室載玻片中的細(xì)胞處理指示的時(shí)間，并用4%PFA固定。(A)、（B)、(D)、